11418.脫氧核糖醛縮酶的基因工程菌構建與表達及初步應用研究

1、分類號：密級：UDC：學號：405813011040南昌大學碩士研究生學位論文脫氧核糖醛縮酶的基因工程菌構建與表達及初步應用研究Construction、expressionofdeoxyriboaldolasesgeneengineeringbacteriapreliminaryapplicationresearchofdeoxyriboaldolases劉松培養(yǎng)單位(院、系)：環(huán)境與化學工程學院指導教師姓名、職稱：余勃副教授申請學位

2、的學科門類：工學學科專業(yè)名稱：生物化工論文答辯日期：答辯委員會主席：評閱人：2014年5月摘要II摘要脫氧核糖醛縮酶(DARE)是一種醇醛縮合裂解酶，普遍存在于動植物及微生物體內(nèi)。DERA在碳碳加成反應中，起著重要作用。特別是它能夠以三分子乙醛或者其他醛酮結構為底物，經(jīng)過兩步羥醛縮合反應得到他汀類藥物手性側(cè)鏈。他汀類藥物能夠降低體內(nèi)膽固醇含量，在降血脂藥物中占有重要地位。DERA作為一個生物催化劑，能夠避免化學方法合成他汀類藥物中所碰到

3、的手性選擇問題，因而，在手性合成反應中具有潛在的應用價值。本文主要通過構建一株原核工程菌和一株真核工程菌來表達DERA，并且研究比較了它們各自所得到的DERA的特性及初步應用研究。主要研究成果如下：1.DERA真核工程菌的構建及表達：采用PCR反應從E.coliBL21(DE3)plysS中擴增得到DERA基因片段，將DERA基因片段與質(zhì)粒載體pPIC9K連接構建得到重組載體pPIC9KDERA，用SalI酶對其酶切后再電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵

4、母GS115感受態(tài)細胞，經(jīng)G418抗性獲得多拷貝產(chǎn)DERA的重組畢赤酵母工程菌(GS115pPIC9K–DERA)；用1%甲醇在不同時機對重組GS115菌株進行誘導表達DERA，經(jīng)SDSPAGE電泳測定，分子量為28.6kDa，該酶在文中表示為：GSDERA。2.DERA原核工程菌的構建及表達：采用PCR反應從BL21擴增得到DERA基因片段，將該基因片段與pETDsbA載體連接得到的重組載體pETDsbADERA；將該重組載體轉(zhuǎn)化至宿

5、主菌BL21，構建得到產(chǎn)DERA的工程菌BL21(pETDsbADERA)；采用IPTG對BL21(pETDsbADERA)菌株誘導培養(yǎng)，離心收集細胞，超聲波破碎細胞后，SDSPAGE電泳檢測顯示，實現(xiàn)了DERA與DsbA的融合表達，得到50kDa左右大小的融合蛋白(DERA：28.6kDa，DsbA：21kDa)，該融合蛋白在文中表示為：BLDERA。3.DERA的分離純化及酶學性質(zhì)研究：1%甲醇誘導培養(yǎng)GS115pPIC9K–DER