莽草酸基因工程菌構(gòu)建與發(fā)酵工藝研究.pdf

1、莽草酸(shikimic acid)是芳香族氨基酸合成中的重要中間產(chǎn)物，具有廣泛的藥用價值，是抗流感藥物“達(dá)菲”的重要合成前體。微生物發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸具有許多優(yōu)點(diǎn)，其中大腸桿菌常應(yīng)用于微生物大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。通過對大腸桿菌進(jìn)行代謝工程改造，是構(gòu)建工業(yè)化莽草酸高產(chǎn)菌的主要技術(shù)手段。該方法不僅生產(chǎn)周期短、成本低、而且對環(huán)境污染少。本文旨在獲得莽草酸基因工程菌，實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案是阻遏莽草酸代謝與支路途徑消耗，以及強(qiáng)化莽草酸代謝途徑。
　　為此本

2、實(shí)驗(yàn)的研究工作為:
　　(1)利用Red同源重組技術(shù)成功構(gòu)建莽草酸激酶AroL與AroK失活的重組菌株E.coli SHIK△aroL、E.coli SHIK△aroK、E.coli SHIK△aroL△aroK，以阻斷莽草酸代謝。并通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，比較了各菌株的生長和產(chǎn)物生成情況，發(fā)現(xiàn)E.coliSHIK△aroL菌株莽草酸合成量較高，生長狀況最好。
　　(2)為減少代謝支路消耗，在E.coli SHIK△aroL基礎(chǔ)上，繼

3、續(xù)利用Red同源重組技術(shù)成功構(gòu)建奎尼酸/莽草酸脫氫酶YdiB失活的重組菌株E.coliSHIK△aroL△ydiB，成功減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。
　　(3)構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-aroG、pTrc99A-aroGE、pTrc99A-aroGED、pTrc99A-aroGEDB，以增強(qiáng)莽草酸途徑的代謝流量。
　　(4)為防止質(zhì)粒過載，還構(gòu)建了pSTV28-aroB，分別與pTrc99A-aroG、pTrc99A-aroGE、

4、pTrc99A-aroGED，建立雙質(zhì)粒系統(tǒng)。
　　(5)將上述的質(zhì)粒導(dǎo)入E coli SHIK△aroL與E coli SHIK△aroL△ydiB菌株，建立莽草酸基因工程菌。通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)中菌株E.coliSHIK△aroL△ydiB/pTrc99A-aroGEDB產(chǎn)量最高，雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)中E.coliSHIK△aroLydiB/pTrc99A-aroGE/pSTV28-aroB產(chǎn)量最高。
　　(6)利

5、用單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)初步優(yōu)化搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。確定培養(yǎng)基為:葡萄糖8g/L，酵母粉1.0g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏1.0g/L，(NH4)2SO41.6g/L，檸檬酸2g/L,MgSO4·7H2O2g/L,K2HPO4·3H2O7.5g/L,FeSO4·7H2O2mg/L;微量元素混合溶液1mL/L，此條件下E.coliS HIK△aroL△ydiB/p Trc99 A-aroG EDB26 h產(chǎn)酸5.51 g/L，E.coliS