α-葡聚糖酶的基因工程菌構(gòu)建、發(fā)酵及其應(yīng)用研究.pdf

1、葡聚糖(Glucan)是以葡萄糖為單體的聚合物的總稱。制糖工藝過(guò)程出現(xiàn)的葡聚糖主要為α-葡聚糖，又稱右旋糖酐(dextran)，是以α-D-葡萄糖為單體、以1-6鍵連接的直鏈為主鏈(約占95％以上)形成的高分子聚合多糖，其分子式為(C6H10O5)n。從蔗汁到精制產(chǎn)品，所有制糖工藝過(guò)程自始至終存在葡聚糖所引起的不良的影響。葡聚糖的產(chǎn)生和存在使蔗糖損失，明顯增大糖液的粘度，降低糖液的過(guò)濾性，影響煮糖、結(jié)晶與分蜜，增加制煉成本，并且嚴(yán)重影響

2、糖產(chǎn)品的質(zhì)量。
　　 本論文針對(duì)制糖過(guò)程存在的α-葡聚糖的降解、檢測(cè)的難題，構(gòu)建并篩選了高效表達(dá)α-葡聚糖酶的基因工程菌株，并進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)研究；對(duì)發(fā)酵所產(chǎn)α-葡聚糖酶在甘蔗制糖過(guò)程α-葡聚糖的分解清除和醫(yī)藥領(lǐng)域微分子右旋糖酐的生產(chǎn)中進(jìn)行相關(guān)的應(yīng)用研究；成功制備了α-葡聚糖特異性單克隆抗體并研制出α-葡聚糖檢測(cè)試劑盒。主要實(shí)驗(yàn)研究工作如下：
　　 1、α-葡聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建與篩選
　　 通過(guò)基因工程方法，構(gòu)建

3、pPICZα A-DEX重組質(zhì)粒，將源自青霉的α-葡聚糖酶基因整合進(jìn)入畢赤酵母基因組，實(shí)現(xiàn)了外源α-葡聚糖酶融合蛋白的表達(dá)。所構(gòu)建的X-33/pPICZαA-DEX畢赤酵母工程菌株，以甲醇為誘導(dǎo)物，其外源基因通過(guò)醇氧化酶AOX啟動(dòng)子的調(diào)控，得以高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 在國(guó)際上首次構(gòu)建以三磷酸甘油醛脫氫酶GAP啟動(dòng)子作為外源基因啟動(dòng)子的pGAPZα A-DEX重組質(zhì)粒，進(jìn)而構(gòu)建KM71H/pGAPZα A-DEX畢赤酵母工程菌株。該

4、菌株在表達(dá)外源蛋白時(shí)，外源基因通過(guò)GAP啟動(dòng)子的調(diào)控，在以甘油或葡萄糖等為碳源的培養(yǎng)基上無(wú)需誘導(dǎo)物的存在就可以表達(dá)，產(chǎn)酶量和菌體密度具有較強(qiáng)的趨勢(shì)一致性。
　　 2、α-葡聚糖酶基因工程菌的發(fā)酵
　　 對(duì)X-33/pPICZαA-DEX畢赤酵母工程菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，探討了溫度、溶氧、初始pH、接種量、誘導(dǎo)階段甲醇濃度和補(bǔ)料間隔時(shí)間等對(duì)產(chǎn)酶的影響。5L發(fā)酵罐流加培養(yǎng)甲醇誘導(dǎo)型工程菌株產(chǎn)酶，在優(yōu)化的發(fā)酵工藝參數(shù)條件下，

5、α-葡聚糖酶的活力最高可達(dá)1048U/mL，國(guó)內(nèi)領(lǐng)先，并通過(guò)了廣東省科技廳組織的技術(shù)鑒定；5L發(fā)酵罐流加培養(yǎng)KM71H/pGAPZαA-DEX產(chǎn)酶，在優(yōu)化的發(fā)酵工藝參數(shù)條件下，α-葡聚糖酶的活力最高可達(dá)398U/mL。以上兩種不同類型的工程菌各有特點(diǎn)，探索完善其相關(guān)的發(fā)酵工藝，可為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)α-葡聚糖酶打下基礎(chǔ)。
　　 3、α-葡聚糖特異性單克隆抗體的制備及其檢測(cè)試劑盒的研制
　　 以Dextran T-40-BSA

6、交聯(lián)物免疫小鼠，用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆，同時(shí)采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的亞克隆和培養(yǎng)，成功建立了7株雜交瘤細(xì)胞株，其效價(jià)均大于106；經(jīng)純化的抗體其重鏈分子量為50000，輕鏈分子量為23000；與BSA、OVA，蔗糖，葡萄糖等無(wú)任何交叉反應(yīng)，證明抗體的特異性。運(yùn)用獲得的單克隆抗體建立α-葡聚糖定量檢測(cè)免疫比濁法，在國(guó)內(nèi)首次成功研制α-葡聚糖定量檢測(cè)試劑盒，于2010年7月通過(guò)國(guó)家質(zhì)檢總局驗(yàn)收并獲高度評(píng)

7、價(jià)，國(guó)際先進(jìn)，解決了α-葡聚糖(右旋糖酐)快速、準(zhǔn)確、便捷檢測(cè)的難題。α-葡聚糖定量檢測(cè)免疫比濁法有望成為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法乃至國(guó)際統(tǒng)一分析法。
　　 4、α-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及其穩(wěn)定性研究
　　 研究了α-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，表明α-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為45-50℃，最適反應(yīng)pH=4.5-5.0；酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性較好，pH=4.5-5.0時(shí)葡聚糖酶較穩(wěn)定，4℃保存，半衰期約為35天。采用葡萄糖作保護(hù)劑研究了其對(duì)α-葡聚糖

8、酶的穩(wěn)定性影響，表明葡萄糖可以極大地減少酶活的損失；以蔗糖作為保護(hù)劑，在室溫下酶活基本沒(méi)有損失。
　　 5、α-葡聚糖酶在制糖過(guò)程中的應(yīng)用研究
　　 在實(shí)驗(yàn)室研究中，以降粘率、除色率、葡聚糖去除率等指標(biāo)為判斷依據(jù)綜合評(píng)價(jià)α-葡聚糖酶對(duì)蔗汁澄清的效果，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定α-葡聚糖酶的各種使用條件。2009/2010榨季在廣東省臺(tái)山市海宴華僑農(nóng)場(chǎng)糖廠進(jìn)行模擬生產(chǎn)工藝試驗(yàn)，在不同清凈工藝中對(duì)蔗汁的澄清效果試驗(yàn)表明，α-葡聚糖酶對(duì)甘蔗

9、制糖過(guò)程蔗汁的清凈有較大的幫助，對(duì)提高澄清汁的純度尤為明顯；α-葡聚糖酶處理低純度蔗汁后其葡聚糖含量和色值都有較大的下降，表明葡聚糖酶對(duì)低純度蔗汁的效果相當(dāng)明顯。
　　 6、α-葡聚糖酶在合成微分子右旋糖酐中的應(yīng)用研究
　　 創(chuàng)新性地提出腸膜明串珠菌發(fā)酵蔗糖產(chǎn)微分子右旋糖酐新工藝，在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)用α-葡聚糖酶進(jìn)行催化水解協(xié)同作用，通過(guò)控制α-葡聚糖酶的添加量和添加時(shí)間控制右旋糖酐的分子量，一步法直接發(fā)酵生產(chǎn)微分子右旋糖酐