黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建、高效表達(dá)及重組酶性質(zhì)研究.pdf

1、背景：
　　木聚糖酶(Xylanase)[EC3.2.1.8]在木聚糖降解過程中作用非常重要，能夠?qū)⒛揪厶墙到鉃槟咎呛偷途勰咎?。其在環(huán)境、食品、飼料、能源、造紙等行業(yè)均有廣泛的應(yīng)用。產(chǎn)木聚糖酶的微生物分布很廣，不同來源以及不同種類的木聚糖酶具有不同的催化特性，使用各種手段來提高木聚糖酶的產(chǎn)量并降低其生產(chǎn)成本，是亟待解決的問題。
　　目的：
　　構(gòu)建木聚糖酶畢赤酵母基因工程菌，優(yōu)化工程菌產(chǎn)酶條件，實(shí)現(xiàn)木聚糖酶的高效表達(dá);

2、分析重組酶的酶學(xué)性質(zhì)，為木聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.畢赤酵母工程菌構(gòu)建
　　將A.niger XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2和xynZF-3重組到真核表達(dá)載體pPIC9K上，線性化后，分別電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115和KM71中，G418初篩、搖瓶復(fù)篩出4株木聚糖酶高產(chǎn)菌株。
　　2.工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　對(duì)重組菌產(chǎn)酶的接種時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、發(fā)酵培養(yǎng)起始pH、甲醇誘導(dǎo)濃度、誘

3、導(dǎo)時(shí)間等進(jìn)行單因素優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交和響應(yīng)面綜合試驗(yàn)。
　　3.重組酶酶學(xué)性質(zhì)的分析
　　測(cè)定重組酶的最適作用溫度、最適作用pH、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及金屬離子和EDTA對(duì)酶的影響，通過薄層層析分析重組酶的水解產(chǎn)物，測(cè)定重組酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建4種木聚糖酶工程菌，分別命名為GS115/pPIC9K-2、GS115/pPIC9K-3、KM71/pPIC9K-2、KM71/pPIC9

4、K-3，并成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。
　　2.得到4株菌的最優(yōu)發(fā)酵條件，GS115/pPIC9K-2:甲醇濃度1.0％，接種時(shí)間31h，誘導(dǎo)時(shí)間104 h，誘導(dǎo)溫度30℃、發(fā)酵起始pH值4.0;KM71/pPIC9K-2:甲醇濃度2.0％，接種時(shí)間26 h，誘導(dǎo)時(shí)間132 h，誘導(dǎo)溫度30℃、發(fā)酵起始pH6.2;GS115/pPIC9K-3:甲醇濃度2.0％，接種時(shí)間24 h，誘導(dǎo)時(shí)間108 h，誘導(dǎo)溫度30℃、發(fā)酵起始pH6.3;KM7

5、1/pPIC9K-3:甲醇濃度1.75％，接種時(shí)間26 h，誘導(dǎo)時(shí)間132 h，誘導(dǎo)溫度30℃、發(fā)酵起始pH6.5。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果比酶活力分別為36523.2 U·mg-1、8654.28 U·mg-1、139.36 U·mg-1、143.29 U·mg-1。
　　3.酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果如下:GS115/pPIC9K-2最適作用溫度和pH分別是45℃和6.0;KM71/pPIC9K-2最適作用溫度和pH分別是45℃和5.5;GS11

6、5/pPIC9K-3最適作用溫度和pH是45℃和5.0; KM71/pPIC9K-3最適作用溫度和pH是40℃和5.0;Ca2+、Fe2+和EDTA對(duì)重組酶有不同程度的促進(jìn)作用，F(xiàn)e3+、Mn2+、Cu2+對(duì)重組酶具有明顯的抑制作用。這4種重組木聚糖酶在溫度50℃以下，pH5-7范圍內(nèi)酶活力相對(duì)穩(wěn)定。
　　4.薄層層析結(jié)果顯示，重組酶XynZF-2水解樺木木聚糖的產(chǎn)物為:木二糖和五糖。
　　5.4種酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)為:km分別

7、為1.5 mg·L-1、1.25 mg·L-1、3.56 mg·L-1、3.04mg·L-1,Vmax分別為2500μmol·mL-1·min-1、2680μmol·mL-1·min-1、1368μmol·mL-1·min-1、1589μmol·mL-1·min-1。
　　結(jié)論：
　　黑曲霉XZ-3S菌株來源的2種木聚糖酶基因，在畢赤酵母GS115和KM71中成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。發(fā)酵條件優(yōu)化后，畢赤酵母工程菌的產(chǎn)酶量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原