黑曲霉木聚糖酶基因克隆及在釀酒酵母中的表達(dá).pdf

1、木聚糖是自然界存在的可再生的一種植物成分。木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡糖，在飼料、造紙、食品以及能源工業(yè)中有著廣泛的用途。木聚糖酶及木聚糖酶基因的研究是當(dāng)前酶學(xué)研究熱點(diǎn)之一。目前主要集中在高產(chǎn)菌株的選育及木聚糖酶基因的克隆和表達(dá)研究上。本研究對(duì)黑曲霉MC062的木聚糖酶基因進(jìn)行了克隆與釀酒酵母表達(dá)。主要研究結(jié)果如下： 從真菌黑曲霉中提取mRNA合成cDNA的第一條鏈，用PCR方法擴(kuò)增得到一個(gè)編碼endo—β—1，4—xyla

2、nase的基因——XYN7。利用簡(jiǎn)便的RT—PCR方法克隆的木聚糖酶基因?qū)儆贕/11家族。該cDNA序列與南非和波蘭科學(xué)家克隆到的序列非常相似。 cDNA片段的核酸序列含有一個(gè)631bp的開(kāi)放閱讀框，編碼210個(gè)氨基酸殘基。來(lái)源于黑曲霉的編碼木聚糖酶基因XYN7被克隆并在釀酒酵母INVSc1中表達(dá)。XYN7基因構(gòu)建在多拷貝穿梭載體pYES6/CT上，在GALI啟動(dòng)子和CYC1轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的控制下成功在釀酒酵母中表達(dá)。半乳糖誘導(dǎo)

3、24h時(shí)重組蛋白的表達(dá)量最大，酶活可達(dá)62．5IU/mL。 釀酒酵母INVSc1中高效表達(dá)的重組酶最適溫度為55℃，可有效地結(jié)合并水解可溶性木聚糖。該木聚糖酶對(duì)硬木和谷物類木聚塘均有高水解活性。最適pH為3．5，但在很寬的pH范圍內(nèi)都有活性。酶可被CO2+完全抑制，濃度為10 mM/L Fe3+，Zn2+和Mg2+可對(duì)酶產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制（殘余的活性分別為31．9％，41．2％和51．4％），Mn2+能產(chǎn)生弱的激活作用。SDS是酶的