哈茨木霉cbh1基因的克隆及在釀酒酵母中的表達(dá).pdf

1、餐廚垃圾是城市生活垃圾的主要成分，餐廚垃圾的主要成分主要包括淀粉類食物、植物纖維、動(dòng)物蛋白和脂肪，以及碳水化合物等。而由于餐廚垃圾中的纖維素的外部被木質(zhì)部包被且不溶于水的特點(diǎn)，因此，很難將纖維素水解為小分子單糖等物質(zhì)，對(duì)于纖維素的利用率及降解效率也極低。纖維素酶作為可將纖維素降解的一類酶，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。然而由于天然纖維素酶對(duì)于纖維素的降解能力低且提取纖維素酶的成本較高，故利用基因工程技術(shù)構(gòu)建纖維素酶

2、高產(chǎn)菌株的方法應(yīng)運(yùn)而生。酵母表面展示系統(tǒng)作為微生物表面展示技術(shù)的一種，可將目的蛋白展示于酵母細(xì)胞的表面，能夠獨(dú)立完成蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，作為真核表達(dá)系統(tǒng)，具有成熟的蛋白分泌和表達(dá)機(jī)制。因此，憑借其明顯的優(yōu)勢(shì)，取得了廣泛的應(yīng)用。
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的哈茨木霉T88做為出發(fā)菌株，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1484bp的纖維素外切葡聚糖酶cbh1基因，經(jīng)檢測(cè)，該基因無(wú)內(nèi)含子，將目的基因與質(zhì)粒載體連接，成功

3、構(gòu)建重組質(zhì)粒pYD1-cbh1，將重組質(zhì)粒pYD1-cbh1轉(zhuǎn)化到釀酒酵母 EBY100感受態(tài)細(xì)胞中，在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d左右，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，最后將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種至半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)96h，通過(guò)對(duì)表面展示目的蛋白的濃度測(cè)定及酶活測(cè)定，得到在誘導(dǎo)48h時(shí)，表面展示酶的活性最高。
　　通過(guò)對(duì)釀酒酵母表面展示的纖維素外切葡聚糖酶的酶學(xué)特性研究，結(jié)果表明：反應(yīng)的最適溫度是50℃；最適pH值是5.0，pH在4.0～6.0之間酶活保持