哈茨木霉銅脅迫應答相關轉錄因子基因thmea1功能研究.pdf

1、木霉菌（Trtchoderma）作為生物活體制劑農(nóng)藥和肥料的有效成分，在植物病害生物防治、土壤環(huán)境改良方面有巨大的應用潛力。近年來由于銅及含銅化合物被廣泛應用于殺菌劑、化學殺蟲劑及畜牧食品添加劑等，致使土壤銅含量不斷增加，對土壤微生物造成不良影響，引起土壤生態(tài)系統(tǒng)失衡和土壤質量下降。研究木霉菌銅耐受及代謝相關機制，對提高防病效果、改善土壤生態(tài)環(huán)境等具有重要意義。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，生防菌哈茨木霉（T harzianum）Th33中存在

2、一種C2H2型轉錄因子，命名為thmea1，該基因在銅脅迫下發(fā)生差異表達，其編碼的蛋白序列中存在3個與酵母金屬硫蛋白表達激活因子ACE2保守的C2H2結構域，推測該基因可能參與哈茨木霉菌的銅脅迫應答及代謝過程。為進一步研究其功能，本研究采用基因敲除和過表達技術，結合熒光定量PCR技術和轉錄組測序分析，探究了thmea1基因的功能，結果如下:
　　1、參照哈茨木霉Th33基因組信息，設計特異性引物，以Th33菌株cDNA為模板，PC

3、R擴增獲得thmea1基因編碼區(qū)序列。測序結果顯示，該基因全長1446bp，無內含子，擁有1個外顯子，編碼蛋白序列與酵母金屬硫蛋白表達激活因子ACE2及其同源蛋白SWI5存在3個較為保守的C2H2鋅指結構域，推測thmea1為C2H2型轉錄因子基因，序列提交NCBI獲得GenBank登錄號為MF802279。
　　2、采用同源敲除原理構建獲得thmea1基因敲除載體pKH-KO-△thmea1，采用PEG介導的原生質體轉化法，將敲

4、除載體轉入哈茨木霉Th33原生質體，篩選獲得thmea1基因敲除突變株△thmea1。以構巢曲霉gpdA和trpC為啟動子和終止子構建獲得thmea1基因過表達載體pKH-KO-Othmea1，采用PEG介導的原生質體轉化法，將過表達載體轉入Th33原生質體，篩選獲得thmea1基因過表達突變株Othmea1。
　　3、對野生菌Th33、敲除突變株△thmea1和過表達突變株Othmea1的銅離子耐受實驗顯示，在0～24mM/L銅

5、離子濃度下，△thmea1的生長速度顯著快于Th33和Othmea1，氣生菌絲量略多，且銅離子耐受中濃度(MIC50)為192mM/L，較Th33(MIC50170mM/L)和Othmea1(MIC50174mM/L)提高了約129％。銅離子吸附實驗顯示，野生菌和突變株對銅離子的吸附率無顯著差異。綜上表明thmea1基因的缺失提高了哈茨木霉對銅離子的耐受性。
　　4、銅代謝相關基因的qRT-PCR分析顯示，銅脅迫下，△thmea1

6、中的金屬硫蛋白基因(Tha07074)表達水平顯著高于Th33和Othmea1，表達量約為Th33的5倍，推測thmea1基因負調控金屬硫蛋白基因的表達。P型-ATP酶基因(Tha_08191)在Th33和Othmea1中的表達水平顯著高于△thmea1，該轉運酶能夠協(xié)助細胞內銅離子進入高爾基體分泌系統(tǒng)，暗示thmea1的缺失可能會影響銅離子的胞外釋放過程。
　　5、對野生菌Th33和敲除突變株△thmea1進行了08mM/L銅離