哈茨木霉Th--33 GαⅢ基因thga3的功能研究.pdf

1、研究生防菌木霉菌（Trichoderma）的信號(hào)傳遞和調(diào)控機(jī)制，對(duì)探索木霉菌生防機(jī)制、提高生防效果有重要的意義。G蛋白是一種GTP結(jié)合蛋白，介導(dǎo)的細(xì)胞跨膜信號(hào)傳遞系統(tǒng)在調(diào)控真菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、代謝、致病性等過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。典型的絲狀真菌G蛋白由α、β和γ3個(gè)亞基組成，其中Gα亞基包括GαⅠ、GαⅡ、GαⅢ三個(gè)類(lèi)群。一般認(rèn)為，GαⅢ亞基的功能主要表現(xiàn)為影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)酶的活性、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、菌株致病力等，并可能負(fù)調(diào)控真菌的產(chǎn)孢。本研

2、究采用基因敲除、回復(fù)突變技術(shù)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，研究了哈茨木霉GαⅢ亞基的功能。
　　從哈茨木霉Th-33全基因組序列獲得GαⅢ亞基基因thga3序列信息，在基因組中的序列編號(hào)為T(mén)ha08474，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得thga3基因片段并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，完整thga3基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?068bp，共編碼355個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為KY937956。與綠木霉(T.virensXP_013955540.1) GαⅢ亞基

3、的相似性為99％，與深綠木霉(T.atroviride XP_013940666.1L)TGA3的相似性為97％。
　　采用基因敲除和回復(fù)技術(shù)獲得敲除突變株和回復(fù)突變株。首先，構(gòu)建thga3敲除載體pkh-koΔthga3，采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入Th-33原生質(zhì)體，篩選獲得2株thga3敲除突變株Δthga3-17命名為Δthga3，Δthga3-19。構(gòu)建thga3回復(fù)突變載體pkh-ko-G418-thga3，采用

4、相同方法轉(zhuǎn)入Δthga3原生質(zhì)體，篩選獲得回復(fù)突變株Rthga3。
　　對(duì)野生型哈茨木霉菌Th-33、突變株Δthga3及Rthga3進(jìn)行生物學(xué)特性分析。與野生菌相比，Δthga3產(chǎn)孢量下降了94％，生長(zhǎng)速度減慢了15％，對(duì)立枯絲核菌的抑制率降低了26％，重寄生能力喪失，幾丁質(zhì)酶活性降低了23％，菌絲的疏水性喪失。采用qRT-PCR驗(yàn)證疏水性相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，Δthga3疏水蛋白基因Tha_09745的表達(dá)量與野生型相比顯

5、著降低了80％。突變株Rthga3的上述性狀與野生型接近。因此thga3參與調(diào)控木霉菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、疏水性、拮抗、重寄生及幾丁質(zhì)酶活性，同時(shí)調(diào)控疏水蛋白基因Tha_09745的表達(dá)。
　　采用Hiseq2500平臺(tái)對(duì)野生菌Th-33及Δthga3進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采樣時(shí)間選擇PDA培養(yǎng)7d的菌絲樣品，三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分析野生菌Th-33及Δthga3轉(zhuǎn)錄組中G蛋白信號(hào)系統(tǒng)、細(xì)胞壁降解酶類(lèi)和產(chǎn)孢相關(guān)基因的差異表達(dá)。與野生菌相比，Δth

6、ga3有3個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)，分別為T(mén)ha_02907，Tha_03034和Tha_06700;1個(gè)編碼G蛋白信號(hào)調(diào)控蛋白R(shí)GS1的基因Tha_07915上調(diào)表達(dá)，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因Tha_00180、Tha_02554和編碼幾丁質(zhì)酶的基因Tha_09915以及產(chǎn)孢調(diào)控基因編碼brlA蛋白的Tha_09974下調(diào)表達(dá)。由此推測(cè)，thga3可能通過(guò)調(diào)控Tha_09974的表達(dá)，正調(diào)控產(chǎn)孢;通過(guò)調(diào)控幾丁質(zhì)酶基因Tha_00180