瑞氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄因子功能及染色質(zhì)修飾在酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用研究.pdf

1、絲狀真菌是自然界中降解木質(zhì)纖維素的主要微生物類別，其中瑞氏木霉（Trichoderma reesei，紅褐肉座菌Hypocrea jecorina的無性型）是最重要的代表菌株，其可以產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三類不同的纖維素降解酶，其中外切纖維素酶CBHⅠ占瑞氏木霉分泌纖維素酶系的60％。研究表明，CBHⅠ基因的表達受到碳源的嚴格調(diào)控，在纖維素存在條件下，其表達量可提高1000倍以上，而在葡萄糖條件下，其表達被完全抑

2、制。目前，纖維素酶的高效誘導(dǎo)表達機制的研究尚處于探索階段。
　　 近幾年的研究工作主要集中于對主要纖維素酶基因的啟動子活性進行分析，分離鑒定了幾個與啟動子相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，它們通過正調(diào)控與負調(diào)控的雙重控制機制調(diào)控纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄表達。其中，Cre1是最早鑒定的與啟動子相互作用的碳代謝抑制因子，可以結(jié)合在cbh1基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游700bp的5‘-SYGGRG-3’反向重復(fù)序列上，Cre1的缺失導(dǎo)致在葡萄糖培養(yǎng)條件中發(fā)生去阻

3、遏。然而，Cre1并不參與所有纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，比如cbh2，xyn2及bgl1;隨后通過酵母單雜交體系獲得了轉(zhuǎn)錄因子Ace1和Ace2，體外結(jié)合實驗表明二者識別的共有序列分別為AGGCA和GGSTAATA，最初這兩個蛋白都被認為具有轉(zhuǎn)錄激活活性，但后續(xù)試驗表明，ace1缺失后xyn1及一些纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平提高，而ace2缺失后導(dǎo)致cbh1，cbh2，egl1及egl2轉(zhuǎn)錄mRNAs的誘導(dǎo)動力學(xué)降低，且誘導(dǎo)后期相關(guān)纖維素酶及X

4、yn2酶活降低30-70％;木聚糖酶調(diào)控因子Xyr1是作為黑曲霉中轉(zhuǎn)錄因子XlnR的同源蛋白被得以鑒定識別，該基因的缺失造成包括cbh1，cbh2，egl1，xyn1與xyn2在內(nèi)的主要纖維素酶和半纖維素酶基因的不轉(zhuǎn)錄，是纖維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子。此外，體外實驗表明Xyr1可結(jié)合到單獨或反向重復(fù)的GGC(A/T)3序列上。上述轉(zhuǎn)錄因子的鑒定以及對它們不同結(jié)合位點的識別，意味著纖維素酶基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄是一個多轉(zhuǎn)錄因子參與

5、、與順式調(diào)控元件相互作用的復(fù)雜過程。
　　 真核生物的染色體是由核小體組成的，核小體結(jié)構(gòu)過于緊密通常會阻礙RNA polⅡ的結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄，因此基因轉(zhuǎn)錄的激活除了需要轉(zhuǎn)錄激活因子與靶 DNA序列的結(jié)合外，啟動子區(qū)域的局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、重構(gòu)和修飾也是必需的。這種染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化主要包括組蛋白的翻譯后修飾以及ATP-依賴的重構(gòu)復(fù)合物的形成。T.reesei是一種絲狀真菌，因此纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄也應(yīng)該存在這種控制機制。目前，已經(jīng)證實纖

6、維素酶基因cbh2的轉(zhuǎn)錄與核心啟動子區(qū)的核小體定位和移除有關(guān)，但這種染色質(zhì)發(fā)生變化的機制目前未見報道。因此，本論文針對纖維素酶基因的高效表達機制進行了系統(tǒng)研究，包括組蛋白的乙酰化修飾和染色體重構(gòu)在纖維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄中的作用和機制，主要結(jié)果如下:
　　 一、分離鑒定了T.reesei中的一個乙?；D(zhuǎn)移酶基因Tr_gcn5，證明了該基因在碳源代謝、菌絲生長、孢子形成及纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要功能
　　 Gcn5是在酵母中

7、發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白乙?；?，參與基因的轉(zhuǎn)錄激活過程。本研究通過氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析首次在T.reesei中分離鑒定了酵母Gcn5的同源蛋白TrGcn5，并在酵母中通過功能回補實驗證明了該蛋白具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性。進一步發(fā)現(xiàn)該基因在T.reesei中缺失后，菌株在不同碳源的培養(yǎng)基上的生長能力下降，菌絲體的形態(tài)也發(fā)生了實質(zhì)性變化，最顯著的是缺失菌株基本喪失了孢子形成能力。除此以外，gcn5敲除菌株中主要的纖維素酶基因cbh1在誘導(dǎo)過

8、程中的轉(zhuǎn)錄一直維持在很低的水平，發(fā)酵液中也檢測不到相應(yīng)的纖維素酶活性。我們的結(jié)果顯示在T.reesei中，gcn5對基因組水平上的基因表達有廣泛的影響，參與了碳源代謝、菌絲生長、無性生殖以及包括纖維素酶誘導(dǎo)在內(nèi)的壓力響應(yīng)過程。
　　 二、通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序，從全基因水平上考察了野生菌株和Δgcn5菌株在纖維素酶誘導(dǎo)過程中的基因轉(zhuǎn)錄差異，從而系統(tǒng)深入的分析了gcn5基因缺失對細胞的誘導(dǎo)響應(yīng)、信號傳遞、能量合成、基礎(chǔ)代謝等途徑的影

9、響和可能的機制，為揭示纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了更詳盡的數(shù)據(jù)和較清晰的脈絡(luò)。
　　 分別提取同樣誘導(dǎo)條件下的野生菌株和Δgcn5菌株的RNA，分離mRNA后進行全序列測定，對測序得到的數(shù)據(jù)進行分析歸類后，得到了以下結(jié)果:(1)兩株菌響應(yīng)纖維素誘導(dǎo)條件的基因不同。野生菌株有703個基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而Δgcn5菌株有804個基因轉(zhuǎn)錄上調(diào);有422個轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因重疊;分別占差異表達基因總數(shù)的31.5％和33.4％;說明Δgcn5菌

10、株在誘導(dǎo)條件下有更多的基因表現(xiàn)為上調(diào)來回補gcn5缺失造成的影響;(2)表達差異的基因主要集中在碳水化合物的合成和分解代謝過程中。通過GO(Gene Ontology)顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，碳水化合物降解和代謝途徑差異較大，推測在該途徑中的影響是特異的。同時，由于gcn5的缺失對葡聚糖代謝的影響，造成了細胞壁合成的障礙，也妨礙了孢子的形成;(3)Δgcn5菌株中細胞骨架調(diào)控途徑中只有兩個基因上調(diào)，一個基因下調(diào)，但這種變化抑制了肌動蛋白的合

11、成，這可以解釋菌絲的生長和擴散變?nèi)?，可能也是孢子不能形成的原?(4)兩株菌的差異表達基因在氧化磷酸化，TCA循環(huán)和糖酵解途徑中都沒有表現(xiàn)出顯著富集，說明gcn5的缺失并沒有影響胞內(nèi)的能量水平;(5)主要的纖維素酶基因以及轉(zhuǎn)錄激活因子Xyr1在gcn5的缺失的情況下都不能轉(zhuǎn)錄，這種影響途徑是特異的;(6)在Δgcn5菌株中一共發(fā)現(xiàn)了三個具有乙?；富钚缘奈粗鞍壮霈F(xiàn)轉(zhuǎn)錄上調(diào)，部分回補了由于gcn5缺失造成的影響。
　　 三、通過

12、優(yōu)化條件，改進了T.reesei的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù);進一步分析了誘導(dǎo)過程中主要纖維素酶基因啟動子上的組蛋白乙?；兓?br>　　 經(jīng)典的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）多以哺乳動物細胞或酵母菌為基礎(chǔ)建立，T.reesei為絲狀真菌，對ChIP結(jié)果準確性的可能造成影響的因素不明確，因此我們對通過逐一考察ChIP實驗中的每個環(huán)節(jié)，對經(jīng)典的染色體免疫共沉淀的技術(shù)進行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為:甲醛交聯(lián)的時間確定為10 min，菌體震蕩破碎的最佳

13、條件為200μl菌體+200μl破碎珠+500μl裂解液，5000 rpm20s運行3次，全細胞破碎液離心之后用35％的超聲破碎功率進行破碎，同時確定了細胞裂解液中去污劑的成分及濃度。通過優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)T.reesei中ChIP關(guān)鍵的控制點為甲醛交聯(lián)時間和染色體的破碎程度，對結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性最重要。
　　 為了驗證優(yōu)化和改進的ChIP方法的可行性，我們選取了可以有效識別T.reesei組蛋白H4和H3乙酰化的抗體，研究了T

14、.reesei纖維素酶基因cbh1的轉(zhuǎn)錄曲線，對cbh1和cbh2基因在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄時啟動子上組蛋白的乙酰化水平進行了檢測，證實了該技術(shù)方案可在T.reesei中應(yīng)用。為深入研究纖維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄時啟動子上組蛋白的乙?；淖兓腿旧|(zhì)的重構(gòu)，以及這些變化與纖維素酶基因高效轉(zhuǎn)錄之間的關(guān)系奠定了堅實的基礎(chǔ)。
　　 四、闡明了啟動子區(qū)核小體組蛋白的乙酰化水平是影響纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄的重要因素，而乙?；窯cn5通過影響轉(zhuǎn)錄因子xyr1基因

15、啟動子上組蛋白的乙?；揭约昂诵◇w的丟失來影響xyr1基因的轉(zhuǎn)錄，從而進一步調(diào)控纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄
　　 首先分析了不同的誘導(dǎo)碳源的培養(yǎng)條件下，野生型和Δgcn5菌株中cbh1基因啟動子的乙?；?，發(fā)現(xiàn)前者誘導(dǎo)條件下cbh1基因啟動子區(qū)乙酰化水平不同程度提高，而后者始終維持在非誘導(dǎo)水平;推測乙?；乃?jīng)Q定著纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，因此又構(gòu)建了組蛋白持續(xù)乙?；?Q)和非乙酰化(R)的突變體，進一步證實了組蛋白乙酰化水平變化能

16、夠影響纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄。當檢測纖維素酶基因通用的轉(zhuǎn)錄激活因子xyr1基因的轉(zhuǎn)錄水平時發(fā)現(xiàn)其在Δgcn5菌株中喪失轉(zhuǎn)錄。在其他組蛋白突變體中，其轉(zhuǎn)錄水平都受到不同程度的影響，同時發(fā)現(xiàn)，xyr1轉(zhuǎn)錄水平的高低對應(yīng)著cbh1基因轉(zhuǎn)錄水平的高低，因此，我們又研究了Δxyr1菌株中cbh1基因啟動子的乙?；?，發(fā)現(xiàn)xyr1的缺失也影響了乙酰化水平。因此我們推測xyr1的轉(zhuǎn)錄受到其自身啟動子的乙酰化水平的影響，一旦Xyr1結(jié)合到纖維素酶基因啟動

17、子，又會征募組蛋白乙?；笍?fù)合物，引起纖維素酶基因啟動子上的乙?；降淖兓?，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄。
　　 綜合以上結(jié)果我們可以推測Gcn5參與的組蛋白乙?；c纖維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄之間之間的關(guān)系模式圖:在纖維素酶誘導(dǎo)過程中，首先乙酰化酶Gcn5通過改變xyr1基因啟動子上組蛋白的乙?；剑瑓⑴c了xyr1基因的轉(zhuǎn)錄過程;當xyr1轉(zhuǎn)錄翻譯后便結(jié)合到cbh1基因啟動子上，開始征募Gen5乙酰化酶復(fù)合物，進而又使cbh1啟動子上組蛋白的乙酰

18、化水平提高，從而引起轉(zhuǎn)錄起始位點的暴露，有利于RNA聚合酶的結(jié)合而起始轉(zhuǎn)錄。
　　 五、通過酵母單雜交實驗對轉(zhuǎn)錄因子Xyr1與纖維素酶基因啟動子的相互作用以及轉(zhuǎn)錄激活性質(zhì)進行了分析
　　 自纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄因子Ace1，Ace2和Xyr1被相繼鑒定后，已報道的結(jié)果主要集中于通過遺傳學(xué)手段研究這些基因缺失后對纖維素酶基因表達的影響，以及通過體外凝膠遷移實驗(EMSA)在體外證明了這三個轉(zhuǎn)錄因子可明顯結(jié)合特定的DNA序列。

19、但是關(guān)于這些蛋白在體內(nèi)與纖維素酶基因啟動子相互作用的實驗證據(jù)，目前尚未見報道。因此，我們分別選取包含Xyr1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和激活結(jié)構(gòu)域(AD)的不同長度的DNA序列，導(dǎo)入含有不同啟動子控制的報告基因的釀酒酵母中，通過酵母單雜交體系來研究Xyr1與DNA的相互作用，并試圖對其AD結(jié)構(gòu)域定位。結(jié)果表明，在釀酒酵母中Xyr1的DBD區(qū)不能有效的結(jié)合cbh1啟動子，同時其AD區(qū)也沒有表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄激活活性，可能有以下原因:1）Xyr1

20、 DBD與Gal4 AD的雜合蛋白在釀酒酵母中折疊錯誤或其它原因?qū)е碌鞍撞环€(wěn)定，進而影響了其功能;2）雜合蛋白封閉了Xyr1與DNA相互作用的位點;3）雜合蛋白在釀酒酵母中不能準確地定位到細胞核內(nèi)，導(dǎo)致無法與靶DNA結(jié)合。此外，研究還發(fā)現(xiàn)米曲霉中的轉(zhuǎn)錄因子XlnR(Xyr1的同源蛋白)與靶DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活能力有效發(fā)揮的前提是該蛋白發(fā)生磷酸化修飾，而構(gòu)巢曲霉中參與氨代謝的轉(zhuǎn)錄因子NirA（鋅核雙簇蛋白）的定位和與DNA的結(jié)合需要GAT