瑞氏木霉Ras信號途徑對形態(tài)建成和纖維素酶合成的作用研究及酶系改良.pdf

1、瑞氏木霉是廣泛存在于自然界中的一種腐生性絲狀真菌，它能夠有效地降解木質(zhì)纖維素材料并以此為生。其對木質(zhì)纖維素材料的降解在地球碳源循環(huán)過程中起到了重要作用。由于具有強(qiáng)大的纖維素分解能力和快速生長的特點，瑞氏木霉長期以來被作為研究纖維素降解的模式菌株。瑞氏木霉對木質(zhì)纖維素的降解主要依靠其強(qiáng)大的纖維素酶和半纖維素酶分泌能力以及有效利用底物快速生長的能力。雖然瑞氏木霉基因組編碼了相對少量的纖維素酶、半纖維素酶和幾丁質(zhì)酶基因，但是它卻能有效地感應(yīng)環(huán)

2、境中的底物（如纖維素）信號及其他環(huán)境信號并作出快速的響應(yīng)以使其能適應(yīng)多變的環(huán)境并繁盛整個種群，而這很大程度上是通過高效的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制實現(xiàn)的。盡管近幾十年對瑞氏木霉纖維素酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，使我們積累了大量關(guān)于纖維素酶及其表達(dá)調(diào)控特征的信息，然而對于瑞氏木霉是如何感受環(huán)境信號調(diào)控其生長發(fā)育和纖維素酶合成的過程并不十分清楚。Ras小GTPase蛋白所介導(dǎo)的信號途徑是絲狀真菌感受環(huán)境信號調(diào)控發(fā)育及基因表達(dá)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，然而目前對于Ra

3、s小GTPase在瑞氏木霉中的功能并不了解。本論文主要研究了Ras小GTPase在瑞氏木霉生長發(fā)育及纖維素酶表達(dá)合成過程中的調(diào)控作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步分析。
　　 另外，由于瑞氏木霉具有強(qiáng)大的纖維素酶分泌能力，它被廣泛地應(yīng)用于纖維素酶的生產(chǎn)及纖維素底物的糖化發(fā)酵。然而，瑞氏木霉纖維素酶系存在缺少木質(zhì)素降解酶和β-葡萄糖苷酶含量較低的缺點，這在一定程度上制約了其工業(yè)應(yīng)用。為了進(jìn)一步降低瑞氏木霉纖維素酶的用酶成本，我們通過基

4、因工程的方法在瑞氏木霉中分別表達(dá)了外源性的木質(zhì)素降解相關(guān)酶漆酶和過表達(dá)了其自身的β-葡萄糖苷酶，以期為酶系改良提供一種有效的策略。
　　 1.Ras小GTPase信號途徑調(diào)控瑞氏木霉生長發(fā)育
　　 在瑞氏木霉基因組中，利用BLASTP程序搜索到與釀酒酵母Ras1同源性較高的5個Ras小GTPase蛋白TrRas1、TrRas2、TrRsr1、Tr107035和Tr66480。同源比對分析發(fā)現(xiàn)這5個蛋白均含有Ras小GTP

5、ase家族的功能相關(guān)保守結(jié)構(gòu)域，并且均能在瑞氏木霉中正常表達(dá)。其中，TrRas1、TrRas2和TrRsr1在瑞氏木霉的生長發(fā)育和碳源利用過程中發(fā)揮了重要作用。具體地，敲除TrRas1導(dǎo)致瑞氏木霉項端生長變慢，菌絲變得短小粗壯，菌落變小呈酵母狀且不能正常延伸。相似地，TrRas2也參與調(diào)控了菌絲的頂端發(fā)育和分支形成。敲除TrRas2導(dǎo)致菌絲頂端生長變慢，分支增多，菌落邊緣不規(guī)則，氣生菌絲變少，生孢延遲。而持續(xù)性激活TrRas2導(dǎo)致菌絲分

6、支變少且更傾向于頂端生長，但是仍會導(dǎo)致頂端延伸變慢。同時TrRas2的持續(xù)性激活也造成瑞氏木霉菌落缺少氣生菌絲，不能正常生孢。從總體上看，TrRas2在調(diào)控菌絲頂端發(fā)育及菌落形成過程中的作用沒有TrRas1明顯。雖然敲除TrRsr1導(dǎo)致瑞氏木霉頂端生長變慢，但是并不影響瑞氏木霉正常的菌絲和菌落形成及無性生殖過程。另外，TrRas2和TrRsr1的缺失會導(dǎo)致瑞氏木霉對羧甲基纖維素和乳糖兩種碳源的利用能力降低。特別是TrRas2的缺失將導(dǎo)致

7、瑞氏木霉不能降解纖維素產(chǎn)生水解圈，表明TrRas2可能參與了瑞氏木霉纖維素酶的表達(dá)調(diào)控。
　　 通過對TrRas1和TrRas2作用機(jī)制的探索性研究，我們發(fā)現(xiàn)TrRas1和TrRas2可能是通過cAMP信號途徑調(diào)控了菌絲的頂端發(fā)育。首先，TrRas1和TrRas2均有升高胞內(nèi)cAMP含量的作用，而TrRas1的作用更為明顯。敲除TrRas1導(dǎo)致cAMP含量相對野生型降低41.4％;持續(xù)性激活TrRas2導(dǎo)致cAMP水平在葡萄糖和

8、纖維素培養(yǎng)基上分別升高34.5％和51.2％，但是TrRas2缺失卻并未對cAMP含量造成明顯影響。其次，外源添加cAMP能夠部分回復(fù)TrRas1缺失造成的菌絲頂端生長缺陷。最后，我們發(fā)現(xiàn)TrRas1和TrRas2能夠與產(chǎn)生cAMP的腺苷酸環(huán)化酶發(fā)生相互作用，這進(jìn)一步的說明TrRas1和TrRas2可能通過調(diào)控腺苷酸環(huán)化酶的活性調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP從而調(diào)控了瑞氏木霉菌絲的頂端發(fā)育。
　　 同時，表達(dá)譜測序分析表明TrRas1和TrR

9、as2調(diào)控了瑞氏木霉能量代謝和氨基酸、磷脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響了瑞氏木霉的生長和細(xì)胞膜形成等過程，進(jìn)而調(diào)控了瑞氏木霉菌絲的發(fā)育。
　　 2.TrRas2介導(dǎo)的信號途徑調(diào)控瑞氏木霉纖維素酶的表達(dá)合成
　　 特別地，我們發(fā)現(xiàn)TrRas2參與調(diào)控了瑞氏木霉纖維素酶的表達(dá)合成。敲除TrRas2導(dǎo)致瑞氏木霉纖維素酶表達(dá)明顯降低并延遲，而持續(xù)性激活TrRas2則使得主要纖維素酶基因cbh1和cbh2的表達(dá)量相對野生型菌株分別

10、提高73％和128％。雖然持續(xù)性激活TrRas2能提高纖維素酶基因的表達(dá)量，但是仍然不能改變?nèi)鹗夏久估w維素酶表達(dá)對纖維素底物的依賴性，說明TrRas2并不是直接介導(dǎo)了纖維素-纖維素酶表達(dá)的信號傳遞過程。深入的研究發(fā)現(xiàn)，主要的纖維素酶基因正調(diào)控因子Xyr1作用于TrRas2的下游，而TrRas2通過調(diào)節(jié)Xyr1的表達(dá)量調(diào)控了瑞氏木霉纖維素酶基因的表達(dá)。另外，TrRas2對纖維素酶負(fù)調(diào)控因子Ace1和Cre1的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，因此TrRa

11、s2也可能通過直接或間接調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量調(diào)控了纖維素酶基因的表達(dá)。
　　 雖然有研究表明cAMP信號途徑調(diào)控了瑞氏木霉纖維素酶表達(dá)，而且我們的研究顯示TrRas2有升高胞內(nèi)cAMP含量的作用，但是敲除TrRas2未造成cAMP含量變化卻導(dǎo)致纖維素酶表達(dá)缺陷的事實表明:TrRas2可能通過提高cAMP含量正向調(diào)控了纖維素酶表達(dá)，而同時TrRas2還可以通過cAMP信號途徑之外的其他途徑調(diào)控纖維素酶表達(dá)。此外，我們的研究結(jié)果

12、還排出了TrRas2直接介導(dǎo)光信號調(diào)控纖維素酶表達(dá)的可能性。
　　 另外，通過表達(dá)譜測序我們發(fā)現(xiàn)TrRas2正向調(diào)控了瑞氏木霉大部分木質(zhì)纖維素降解酶的表達(dá)，從而在瑞氏木霉降解木質(zhì)纖維素的過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 總之，本論文的研究初步闡明了Ras小GTPase對瑞氏木霉形態(tài)建成和纖維素酶表達(dá)的調(diào)控作用及其作用機(jī)制，對解釋以瑞氏木霉為代表的絲狀真菌的高效的木質(zhì)纖維素降解能力具有重大意義。
　　 3.基因工程手段

13、優(yōu)化瑞氏木霉纖維素酶系
　　 為了改良瑞氏木霉纖維素酶系，本論文通過遺傳工程的方法在瑞氏木霉中過表達(dá)了內(nèi)源性的β-葡萄糖苷酶。其中，我們使用了本實驗室構(gòu)建的4拷貝cbh1強(qiáng)啟動子過表達(dá)β-葡萄糖苷酶基因bgl1。對酶活力的測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子的β-葡萄糖苷酶活力是出發(fā)菌株的1.8-3.7倍，并且過表達(dá)β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化子的纖維素酶對木質(zhì)纖維素底物木糖渣的糖化效率相比出發(fā)菌株提高了11-29％。另外，我們在瑞氏木霉中異源表達(dá)了來自T

14、rametes sp.AH28-2的木質(zhì)素降解相關(guān)酶漆酶LacA。將漆酶基因lacA置于來源于Aspergillus nidulans的gpdA啟動子下游并融合瑞氏木霉的Cbh1的信號肽序列以利于重組漆酶的表達(dá)和分泌?；钚許DS-PAGE結(jié)果顯示瑞氏木霉轉(zhuǎn)化子能成功表達(dá)并分泌重組漆酶，以ABTS為底物進(jìn)行測定時漆酶活力能達(dá)到3.62 IU/ml，而且該重組漆酶的性質(zhì)與來自Trametes sp.AH28-2的原始漆酶非常接近。漆酶轉(zhuǎn)化子