瑞氏木霉纖維素酶基因cbh1啟動(dòng)子突變分析及psi因子合成酶基因的功能研究.pdf

1、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是工業(yè)化的纖維素酶生產(chǎn)菌株，可以分泌高效降解纖維素的酶系，其中纖維二糖水解酶CBHⅠ是降解纖維素的重要酶組分。瑞氏木霉纖維素酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)受到碳源、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及很多與次級(jí)代謝有關(guān)因素的影響。
　　瑞氏木霉纖維素酶基因cbh1啟動(dòng)子上存在大量的5'-GG(A/T)3-3'序列，其中5個(gè)5'-GGC(A/T)3-3'序列能夠與轉(zhuǎn)錄激活因子Xyr1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Xyr1DBD)結(jié)

2、合。本論文采用體外酵母單交雜方法與瑞氏木霉體內(nèi)檢測(cè)cbh1啟動(dòng)子的突變體活性相結(jié)合的手段，研究了這5個(gè)5'-GGC(A/T)3-3'序列中第二個(gè)鳥嘌呤核苷酸的突變對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Xyr1與其結(jié)合能力的影響。同時(shí)，本文通過構(gòu)建瑞氏木霉缺失突變體的手段，研究了參與多種次級(jí)代謝產(chǎn)物合成過程的psi因子合成酶Ppo對(duì)纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響。
　　本論文取得的的主要研究結(jié)果如下:
　　1.酵母單雜交分析cbh1啟動(dòng)子點(diǎn)突變后活性變化，證明轉(zhuǎn)

3、錄因子Xyr1可能與cbh1啟動(dòng)子中的4個(gè)5'-GGC(A/T)3-3'序列結(jié)合而影響cbh1的表達(dá)。
　　為了探討Xyr1與cbh1啟動(dòng)子可能的結(jié)合位點(diǎn)及相互作用機(jī)制，對(duì)啟動(dòng)子中5個(gè)5'-GGC(A/T)3-3'序列（分別位于cbh1啟動(dòng)子上-187R、-320、-510R、-733R、-778位）中第二個(gè)鳥嘌呤核苷酸分別進(jìn)行了點(diǎn)突變。采用酵母單雜交的技術(shù)手段，通過檢測(cè)報(bào)告基因lacZ表達(dá)的β-半乳糖苷酶酶活水平來(lái)研究這些點(diǎn)突變

4、對(duì)Xyr1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Xyr1DBD)與啟動(dòng)子結(jié)合能力的影響。結(jié)果顯示，突變位點(diǎn)為cbh1p-510R的突變株的β-半乳糖苷酶酶活與表達(dá)野生型cbh1啟動(dòng)子的菌株基本一致;突變位點(diǎn)分別為cbh1p-187R、cbh1p-320、cbh1p-733R、cbh1p-778的突變株的酶活則分別下降了23％、15％、26％和24％。據(jù)此推測(cè)，cbh1p-187R、cbh1p-320、cbh1p-733R和cbh1p-778四個(gè)位點(diǎn)處的5

5、'-GGC(A/T)3-3'序列均有可能參與了Xyr1與cbh1啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　2.在瑞氏木霉體內(nèi)利用uidA作為報(bào)告基因分析cbh1啟動(dòng)子點(diǎn)突變對(duì)其活性的影響，證明5'-GGC(A/T)3-3'序列參與了Xyr1與cbh1啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　通過構(gòu)建表達(dá)載體，將上述cbh1啟動(dòng)子上5個(gè)六核苷酸序列5'-GGC(A/T)3-3'中第二個(gè)鳥嘌呤核苷酸分別突變的啟動(dòng)子序列分別表達(dá)在瑞氏木霉中，采用uidA作為報(bào)告基因，通過檢

6、測(cè)GUS酶活水平分析突變后的cbh1啟動(dòng)子活性，并與體外酵母單雜交實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和比較。
　　結(jié)果顯示，突變位點(diǎn)為cbh1p-510R的突變株酶活與野生型基本一致;突變位點(diǎn)分別為cbh1p-187R、cbh1p-320、cbh1p-733R、cbh1p-778的突變株酶活分別下降了50％、43％、45％和43％。推測(cè)點(diǎn)突變對(duì)cbh1啟動(dòng)子活性的影響主要是由轉(zhuǎn)錄因子Xyr1與啟動(dòng)子相互作用的變化引起，cbh1p-187R、c

7、bh1p-320、cbh1p-733R、cbh1p-778位點(diǎn)處的六核苷酸序列參與了Xyr1與cbh1啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　3.編碼瑞氏木霉psi因子合成酶Ppo基因ppoa和ppob的缺失突變表明，ppo基因參與碳源底物代謝，影響菌體生長(zhǎng)。
　　Psi因子合成酶Ppo參與了很多次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成過程。為了研究psi因子合成酶在瑞氏木霉纖維素酶誘導(dǎo)合成中的作用，我們對(duì)兩個(gè)編碼psi因子合成酶的基因ppoa和ppob分別進(jìn)行了基