里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄因子及輔調(diào)控因子的篩選鑒定及功能分析.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上含量最為豐富的碳水化合物之一，絲狀真菌是自然界中降解木質(zhì)纖維素的主要微生物類別，而里氏木霉（Trichoderma reesei）是其中的典型代表。在纖維素等底物存在的條件下，里氏木霉能表達分泌大量的纖維素酶以實現(xiàn)對纖維素的高效降解，因此成為纖維素酶工業(yè)的主要生產(chǎn)菌株。
　　目前對里氏木霉纖維素酶表達合成的研究主要集中在兩個方面:一方面集中在纖維素酶基因的表達調(diào)控方面，以期從理論上闡釋產(chǎn)酶調(diào)控機制，從而為通過菌株

2、的遺傳改造提升纖維素酶的表達水平提供理論支持;另一方面，通過對里氏木霉現(xiàn)有酶系組分的性能改善或合理復配以提高其酶解效率。在纖維素酶基因表達調(diào)控方面，目前已經(jīng)鑒定到了多個直接參與酶基因表達的轉(zhuǎn)錄因子包括正調(diào)控因子及負調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)錄因子在啟動子上具有各自特定的結(jié)合位點及生物學功能，這意味著纖維素酶基因的誘導轉(zhuǎn)錄是一個多轉(zhuǎn)錄因子參與，從而響應不同環(huán)境信號的復雜過程。為了更為深入地了解這一復雜過程，有必要篩選鑒定纖維素酶基因表達

3、過程中涉及的其他未知轉(zhuǎn)錄因子及輔功能因子，從而解析里氏木霉纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡。
　　此外，作為真菌的里氏木霉，其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化包括重構(gòu)和核小體共價修飾可能也是纖維素酶基因誘導表達過程中的重要影響因素，系統(tǒng)闡述此種變化在里氏木霉纖維素酶基因表達過程中的作用對全面理解相關(guān)調(diào)控機制也極為重要。因此，論文工作主要從上述幾個方面展開，取得相應結(jié)果如下:
　　一、鑒定了一個新的纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄抑制因子Rce1，其通過與Xyr1

4、在纖維素酶基因啟動子上競爭性結(jié)合參與纖維素酶基因的表達調(diào)控
　　以里氏木霉主要的纖維素酶基因啟動子(Pcbh1)為“誘餌”，從里氏木霉cDNA文庫中篩選獲得了真菌典型轉(zhuǎn)錄因子Ga14類型的轉(zhuǎn)錄因子Rce1。細胞定位分析發(fā)現(xiàn)Rce1主要位于細胞核。對rce1的缺失及過表達分析表明，Rce1在纖維素酶表達過程中發(fā)揮抑制作用。通過體外的凝膠泳動遷移(EMSA)及DNA足跡保護(DNAse Ifootprinting)實驗鑒定了Rce1在

5、cbh1啟動子上的結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)其與纖維素酶基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子Xyr1具有相似的結(jié)合位點。進一步通過體外競爭及染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗分析發(fā)現(xiàn)，Rce1在纖維素誘導表達過程中與Xyr1競爭性結(jié)合纖維素酶基因啟動子，進而實現(xiàn)對纖維素酶表達的抑制作用，而xyr1過表達可以解除rce1對纖維素酶的表達抑制。綜上所述，我們通過酵母單雜交篩選到一個轉(zhuǎn)錄抑制因子Rce1，通過與轉(zhuǎn)錄激活因子Xyr1競爭性結(jié)合纖維素酶基因啟動子來調(diào)控纖維素

6、酶的表達。
　　二、發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶TrUbc4在里氏木霉纖維素酶表達過程中發(fā)揮重要作用
　　以纖維素酶基因啟動子cbh1為“誘餌”，從里氏木霉cDNA文庫中還篩選獲得了一個屬于UBC超家族的泛素結(jié)合酶TrUbc4。細胞定位分析發(fā)現(xiàn)TrUbc4定位于細胞核。TrUbc4編碼基因的敲除顯著降低了里氏木霉纖維素酶基因的誘導轉(zhuǎn)錄和表達。突變體回補實驗發(fā)現(xiàn)，TrUbc4的活性位點C85在纖維素酶表達過程中發(fā)揮著重要作用。在Xyr1過表

7、達菌株中缺失Trubc4并分析表型發(fā)現(xiàn)，Xyr1的過表達并不能恢復Trubc4缺失對纖維素酶表達造成的的下調(diào)。進一步的ChIP分析發(fā)現(xiàn)，Trubc4缺失導致Xyr1在纖維素酶基因啟動子區(qū)的占據(jù)水平顯著降低，這種降低即使在Xyr1過表達的情況下仍然存在。以TrUbc4為“誘餌”進行酵母雙雜交文庫篩選，獲得了具有SWIB/MDM結(jié)構(gòu)域的蛋白TrSnf12。該基因的缺失表型及蛋白細胞定位與TrUbc4類似，但是我們并沒有檢測到TrSnf12的

8、泛素連接酶活性。綜合上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)Trubc4在纖維素酶基因誘導表達過程中發(fā)揮著重要作用，此種作用是特異性的，并且依賴于其泛素結(jié)合酶活性。
　　三、泛素修飾組學初步分析TrUbc4可能參與里氏木霉多種生理調(diào)控過程
　　對TU6以及Trubc4缺失菌進行了泛素化蛋白質(zhì)組學定量研究，鑒定到位于1385個蛋白上的2563個泛素化位點，其中941個蛋白的1623個位點包含定量信息。以1.5倍為變化閾值，在具有定量信息的泛素化位點

9、中，△Trubc4/TU6比較組中有396個位點的修飾水平發(fā)生上調(diào)，298個位點的修飾水平發(fā)生下調(diào)，△Trubc4缺失導致里氏木霉整體的泛素化水平升高。進一步分析發(fā)現(xiàn)與TU6相比，有295個位點，258個蛋白在△Trubc4缺失菌中未檢測到，這些蛋白涉及了轉(zhuǎn)錄因子、泛素結(jié)合酶、蛋白激酶、轉(zhuǎn)運蛋白以及SAGA復合物，這說明Trubc4可能參與里氏木霉多種調(diào)控過程。
　　四、Xyr1招募SWI/SNF復合物參與纖維素酶基因的表達調(diào)控<

10、br>　　酵母雙雜交及體外GST-pull down實驗發(fā)現(xiàn)，所鑒定的里氏木霉?jié)撛诘腟WI/SNF復合物同源亞基TrSnf12與Xyr1的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)區(qū)存在相互作用，并且TrSnf12與同源核心亞基TrSwi1也存在相互作用。Trswi1及另一個同源核心亞基編碼基因Trsnf5的缺失對里氏木霉的生長及生孢均具有嚴重的影響，并且使得纖維素酶的表達性能喪失。ChIP實驗結(jié)果表明，在纖維素誘導條件

11、下，TrSwi1及TrSnf5均能被招募至纖維素酶基因啟動子區(qū)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在Xyr1過表達背景下，即使在非誘導條件下，TrSwi1也能被招募至纖維素酶基因啟動子區(qū)，這說明Xyr1可能通過與TrSnf12之間的相互作用，通過靶向募集TrSwi1來介導纖維素酶基因啟動子區(qū)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，進而調(diào)控纖維素酶基因的表達。然而，對OExyr1Δswi1/snf5的表型分析發(fā)現(xiàn)，在xyr1過表達的條件下，無論是誘導條件還是非誘導條件，Trsw