里氏木霉纖維素酶誘導表達過程中碳源感應機制的研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界中含量最為豐富的可再生資源，其高效循環(huán)利用將有效緩解日益嚴重的能源資源危機。由纖維素特殊的結構組成所形成的天然抗降解屏障是制約其利用的主要瓶頸。自然界中存在許多纖維素降解微生物，它們能夠高效利用纖維素類底物，為纖維素的轉化利用提供了一條有效途徑。絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)便是纖維素降解微生物中的典型代表。
　　由于木質(zhì)纖維素為水不溶性底物，里氏木霉如何感應胞外纖維素存在進而觸發(fā)纖維素

2、酶基因表達以及纖維素來源的信號是如何被感應和傳遞等問題至今沒有明確答案。本論文以里氏木霉纖維素酶誘導表達過程中碳源感應為切入點，分別從纖維二糖轉運蛋白和無轉運活性的類纖維二糖轉運蛋白兩方面研究了纖維素酶編碼基因啟動表達的機理，主要得到以下結果:
　　1.構建了纖維二糖轉運蛋白篩選系統(tǒng)，并首次在里氏木霉中鑒定得到具有纖維二糖轉運活性的轉運蛋白Stp1。
　　利用釀酒酵母不能代謝纖維二糖的特性，通過代謝工程的手段分別在釀酒酵母中

3、表達β-葡萄糖苷酶和候選纖維二糖轉運蛋白，并通過重組酵母以纖維二糖為碳源時的生長情況判定候選轉運蛋白是否具有纖維二糖轉運活性。以此重組酵母為平臺，結合生物信息學預測鑒定到了里氏木霉中第一個具有纖維二糖轉運活性的轉運蛋白，由于它兼有葡萄糖和木糖轉運活性，因此將其命名為SugarTransporter1，簡稱Stp1。
　　2.通過基因敲除證明里氏木霉Stp1不僅影響菌體對纖維二糖的利用，同時對里氏木霉纖維素酶基因的表達也有重要的影響

4、。
　　為研究纖維二糖轉運蛋白在里氏木霉纖維素酶誘導表達中的作用，通過同源雙交換的策略在里氏木霉野生型菌株TU6中對stp1進行敲除，成功得到Stp1缺失突變株△stp1。研究表明，Stp1的缺失一定程度上影響了里氏木霉對纖維二糖的利用，相比于野生型菌株，△stp1以纖維二糖為碳源時生長變慢且最終生物量積累變少。并且Stp1的缺失致使里氏木霉在纖維素誘導時其纖維素酶基因轉錄及發(fā)酵液纖維素酶酶活大幅度提升;而相反的是△stp1的纖維

5、素酶表達不再受纖維二糖的誘導。
　　進一步分析表明Stp1缺失后對纖維二糖響應的消失是由于胞外β-葡萄糖苷酶酶活升高引起，升高的β-葡萄糖苷酶酶活加速胞外纖維二糖水解，產(chǎn)生更多的葡萄糖從而引起葡萄糖阻遏效應抑制纖維素酶基因的表達。但胞外β-葡萄糖苷酶酶活升高并不是纖維素誘導時△stp1菌株纖維素酶酶活升高的主要原因，且Stp1的缺失并不影響槐糖對纖維素酶的誘導。另外，研究還發(fā)現(xiàn)Stp1并不能解除纖維素為碳源時纖維素酶誘導過程中的葡

6、萄糖阻遏效應，至少高濃度葡萄糖存在時Stp1并沒有明顯的解阻遏作用，考慮到Stp1所具備的葡萄糖轉運活性，推測纖維素酶表達過程中Stp1的缺失可能通過減緩葡萄糖向胞內(nèi)的轉運而在一定程度上減緩了葡萄糖阻遏效應的發(fā)生，因此使纖維素酶分泌表達加強。
　　3.通過表達譜測序，從全基因組水平上檢測了野生型菌株TU6和△stp1在纖維素誘導時的基因轉錄差異，發(fā)現(xiàn)一新的類糖轉運蛋白Tr_3405，且其在△stp1中的轉錄得到上調(diào)。
　　為

7、更全面地研究△stp1高纖維素酶活的原因，對野生型菌株和△stp1菌株進行了纖維素誘導下的表達譜測序。野生型菌株755個基因受Avicel誘導上調(diào)表達，其中包括17個纖維素酶編碼基因和28個半纖維素酶編碼基因。受Avicel誘導上調(diào)的這些基因中有98個基因為分泌蛋白編碼基因;21個預測為轉錄調(diào)控因子;31個基因編碼轉運蛋白，其中這31個轉運蛋白中有17個與Stp1一樣屬于MFS超家族;還有30個基因與蛋白分泌有關;另外的282個基因屬于

8、未知功能蛋白編碼基因。整體表達譜測序結果顯示，△stp1中的基因表達譜與野生型菌株相比有697個基因的表達有明顯差別，其中包括139個表達上調(diào)基因和532個下調(diào)表達的基因。差異基因中預測為糖轉運蛋白的MFS超家族的Tr3405受纖維素誘導上調(diào)表達十分顯著，而且其在△stp1中轉錄水平進一步升高。熒光定量PCR和Northern blot實驗進一步驗證了Tr3405受纖維素誘導而發(fā)生上調(diào)表達。
　　4.通過過表達和基因敲除，證明類糖

9、轉運蛋白Tr_3405是里氏木霉纖維素酶誘導表達所必須的調(diào)節(jié)因子，將其命名為Cellulaseregulating transporter1，簡稱Crt1。
　　熒光定量PCR結果顯示當Tr_3405過表達時可以顯著提高纖維素酶基因的轉錄水平。進一步通過同源雙交換策略對Tr_3405進行敲除，發(fā)現(xiàn)Tr_3405的缺失致使里氏木霉不論是在纖維素、纖維二糖為底物還是槐糖誘導的條件下其纖維素酶均不再表達，由此說明Tr_3405是里氏木霉

10、纖維素酶誘導表達所必須的調(diào)節(jié)因子。
　　生物信息學分析顯示Tr_3405在進化上與粗糙脈孢菌纖維二糖轉運蛋白Cdt1和Cdt2及乳酸克魯維屬酵母乳糖轉運蛋白Lacl2具有較高的一致性。但是纖維二糖和槐糖轉運實驗表明Tr_3405并不具有纖維二糖或槐糖轉運活性。因此，Tr_3405可能是以無轉運活性類轉運蛋白的形式參與胞外誘導信號的感應。由此，我們將Tr_3405蛋白命名為類轉運蛋白纖維素酶調(diào)節(jié)因子(Cellulase regula

11、tingtransporter1，簡稱Crt1)。通過pull-down實驗釣取了與Crt1相互作用的蛋白，進一步研究Crt1的信號感應與傳遞的分子機制，初步結果表明Crt1的C端并不穩(wěn)定，這可能與Crt1的信號傳遞功能有關，更深入的實驗結果待進一步分析。
　　5.發(fā)現(xiàn)了一種新型纖維素酶誘導碳源—葡萄糖酸內(nèi)酯。
　　本論文研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸內(nèi)酯擁有略高于纖維二糖的纖維素酶誘導效果，且能夠作為唯一碳源供里氏木霉生長，這是迄今為止

12、發(fā)現(xiàn)的第一個單糖衍生物類的纖維素酶誘導物。研究表明，葡萄糖酸內(nèi)酯誘導纖維素酶表達需要Crt1和纖維素酶基因關鍵轉錄因子Xyr1的參與，不論是Crt1還是Xyr1的缺失都會消除葡萄糖酸內(nèi)酯對纖維素酶的誘導表達。進一步研究表明，胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶Cella在葡萄糖酸內(nèi)酯誘導纖維素酶表達過程中至關重要，它的缺失致使菌體在葡萄糖酸內(nèi)酯誘導下其纖維素酶不再表達，而胞外β-葡萄糖苷酶Bgl1并不影響葡萄糖酸內(nèi)酯的誘導。與纖維素的誘導不同，葡萄糖酸內(nèi)

13、酯誘導纖維素酶的表達受Stp1正調(diào)控，Stp1的缺失會大幅度削弱葡萄糖酸內(nèi)酯為碳源時纖維素酶的表達水平，初步試驗證明這與Stp1的轉運活性有關。
　　本論文發(fā)現(xiàn)了里氏木霉中第一個纖維二糖轉運蛋白Stp1并首次報道了纖維素酶表達調(diào)控的關鍵類纖維二糖轉運蛋白Crt1，這為后續(xù)的纖維素酶表達調(diào)控過程中碳源感應的研究提供了良好的開端。綜合以上結果初步得到以下模型:環(huán)境中的纖維素類底物，在本底表達的纖維素酶作用下釋放微量的纖維二糖，這些纖維

14、二糖與定位于細胞膜上的Crt1相結合后形成的纖維素酶誘導信號經(jīng)下游信號途徑的傳遞最終進入細胞核激活纖維素酶的表達。Stp1是位于細胞膜上的纖維二糖/葡萄糖轉運蛋白，其缺失突變造成最初形成的微量纖維二糖在胞外積累加強了Crt1參與的纖維素酶誘導信號的產(chǎn)生，促進了纖維素誘導下纖維素酶的表達;纖維素酶表達啟動后胞外產(chǎn)生的纖維二糖一部分被轉運進入胞內(nèi)另一部分在胞外被水解成少量的葡萄糖，Stp1的缺失抑制了葡萄糖向胞內(nèi)的轉運也相應抑制了葡萄糖阻遏