利用人工鋅指蛋白技術(shù)提高里氏木霉Rut-C30纖維素酶產(chǎn)量.pdf

1、石油資源儲(chǔ)量不斷減少，而且石油基燃料和化學(xué)品大量使用產(chǎn)生的環(huán)境污染及氣候變化等問(wèn)題日益突出，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)資源豐富且可再生，特別是各類(lèi)農(nóng)林廢棄物，其主要成分半纖維素和纖維素可以水解為糖，進(jìn)而通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料和生物基化學(xué)品。這一生物煉制技術(shù)路線，可望替代石油依賴(lài)型經(jīng)濟(jì)，已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。半纖維素易于水解，但纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要成分提供保護(hù)作用，自然進(jìn)化使其對(duì)水解有強(qiáng)抗性，特別是對(duì)

2、酶的作用。因此，高效低成本纖維素酶成為建立基于纖維素水解的糖平臺(tái)，乃至生物煉制的瓶頸之一。纖維素酶是復(fù)合酶系，主要由纖維二糖水解酶、內(nèi)切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶等組成，高效降解木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)需要多種酶組分的協(xié)同作用。來(lái)自絲狀真菌里氏木霉的Trichoderma reesei Rut-C30是纖維素酶高產(chǎn)菌株之一，已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，但纖維素酶發(fā)酵過(guò)程酶產(chǎn)量低導(dǎo)致成本高的問(wèn)題特別突出，無(wú)法用于木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)資源的生物煉制。T.r

3、eesei纖維素酶合成調(diào)控機(jī)制研究表明，纖維素酶的生物合成主要由Xyr1、Cre1等內(nèi)源轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控，但其他影響因素還有待進(jìn)一步闡明。鋅指蛋白具有鋅指結(jié)構(gòu)，是多種生命體系中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，利用人工設(shè)計(jì)的鋅指蛋白文庫(kù)進(jìn)行改造并選育突變體，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，已廣泛應(yīng)用于大腸桿菌和酵母等微生物，并成功獲得了耐溫性等表型或外源蛋白過(guò)量表達(dá)的突變體，但是目前為止還未見(jiàn)其應(yīng)用在絲狀真菌中的報(bào)道。本研究工作首次探討了人工鋅指蛋白(Artifici

4、al Zinc Finger Protein，AZFP)對(duì)里氏木霉纖維素酶生產(chǎn)的影響，利用AZFP文庫(kù)轉(zhuǎn)化T.reeseiRut-C30，篩選高產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌突變體，并與對(duì)照菌株比較，研究突變體纖維素酶組分和蛋白分泌情況。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴構(gòu)建了適用于絲狀真菌的表達(dá)載體，比較了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，并對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了條件優(yōu)化，確定最佳轉(zhuǎn)化條件為:根癌農(nóng)桿菌AGL-1生長(zhǎng)OD660值達(dá)到

5、0.8時(shí)，在pH5.3、24℃及乙酰丁香酮濃度200μM條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到200個(gè)轉(zhuǎn)化子/106孢子。進(jìn)而，構(gòu)建絲狀真菌人工鋅指蛋白表達(dá)載體文庫(kù)并轉(zhuǎn)化T.reesei Rut-C30，獲得了近600個(gè)轉(zhuǎn)化子，通過(guò)纖維素平板培養(yǎng)和搖瓶液體發(fā)酵篩選，獲得了高產(chǎn)纖維素酶的T.reeseiRut-C30轉(zhuǎn)化子(U3)。⑵對(duì)U3進(jìn)行性能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其纖維素酶活性比出發(fā)菌株提高了55％，通過(guò)RNA定量分析和纖維素酶組分酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定，

6、確定U3菌株的β葡萄糖苷酶活性比出發(fā)菌株提高了8倍，同時(shí)內(nèi)切葡聚糖酶活性提高了28％。利用粗酶液對(duì)堿預(yù)處理玉米秸稈進(jìn)行水解，其葡萄糖收率比出發(fā)菌株T.reesei Rut-C30粗酶液水解過(guò)程提高了115％。這些結(jié)果表明:U3菌株纖維素酶酶系的組成在其人工鋅指蛋白AZFP-U3的作用下發(fā)生了顯著變化，從而提高了纖維素組分的酶解效率。對(duì)AZFP-U3潛在的靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析，結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR的驗(yàn)證結(jié)果，進(jìn)一步選擇并對(duì)四個(gè)可能的靶基因進(jìn)行功

7、能驗(yàn)證，分別編碼兩個(gè)功能未知假定的轉(zhuǎn)錄因子（TrireC30_125610和TrireC30_7183）、線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TrireC30_46633)和糖苷水解酶(TrireC30_88814)基因。構(gòu)建表達(dá)載體，將上述基因在T.reesei Rut-C30中過(guò)量表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)纖維素酶生產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子125610的過(guò)表達(dá)使Rut-C30胞外纖維素酶酶活提高了200％，同時(shí)轉(zhuǎn)化子T125610胞外蛋白分泌能力提高了219％。

8、⑶通過(guò)人工鋅指蛋白文庫(kù)篩選得到的另外一個(gè)轉(zhuǎn)化子U5比U3具有更強(qiáng)的纖維素降解能力，其胞外分泌的纖維素酶活性比出發(fā)菌株提高了112％，同時(shí)檢測(cè)到其胞外蛋白分泌量提高了大約86％。比較U5和出發(fā)菌株發(fā)酵獲得的粗酶液對(duì)堿預(yù)處理后的玉米秸稈進(jìn)行酶解效果，發(fā)現(xiàn)其葡萄糖收率提高了33.9％。主要纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄分析和各組分酶活測(cè)定都表明U5纖維素酶各組分酶活發(fā)生顯著變化，對(duì)U5和出發(fā)菌株進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，進(jìn)一步揭示人工鋅指蛋白提高纖維素酶合成的

9、分子機(jī)理。⑷轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明:培養(yǎng)24 h時(shí)，U5突變株糖苷水解酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及蛋白酶體，參與mRNA監(jiān)測(cè)途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工途徑的基因，轉(zhuǎn)錄水平比出發(fā)菌株有顯著提高，而且過(guò)氧化物酶體、CoA合成途徑、N-糖苷合成途徑、氨酰-tRNA合成途徑、煙酰胺代謝途徑、脂肪酸代謝途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平也有上調(diào)，為纖維素酶轉(zhuǎn)錄和蛋白修飾加工過(guò)程中提供氨基酸前體、輔酶和能量。此外，U5中絲狀真菌蛋白分泌壓力響機(jī)制（RESS）受到激活，在48

10、 h時(shí)尤為明顯，RESS的激活可使過(guò)多的mRNA迅速降解，盡管RESS與纖維素酶合成的關(guān)系還有待深入研究，此時(shí)突變體U5中主要糖苷水解酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)錄量與出發(fā)菌株相比仍然顯著上調(diào)，表明AZFP-U5對(duì)糖苷水解酶轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾具有促進(jìn)作用。AZFP-U5潛在的靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)錄分析也發(fā)現(xiàn)變化，這些基因包括負(fù)責(zé)蛋白翻譯后修飾、信號(hào)傳遞、氨基酸代謝的基因。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，為進(jìn)一步探討人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子在T.reesei中