里氏木霉RUT-C30甘露聚糖酶基因man1在畢赤酵母中的高效表達(dá).pdf

1、甘露聚糖類物質(zhì)是自然界中半纖維素的第二大組分，分布廣泛。β-甘露聚糖酶能水解底物生成甘露寡糖，釋放出與之結(jié)合的水分、微量元素等。應(yīng)用于豬、雞、鴨和水產(chǎn)動物日糧，可提高飼料的利用效率，減少養(yǎng)殖業(yè)環(huán)境污染。甘露寡糖具有改善動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境的功能。多種細(xì)菌、真菌、軟體動物等分泌β-甘露聚糖酶，其基因?qū)儆谔腔饷讣易?。β-甘露聚糖酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)等方面有著廣泛的用途。因此本研究的主要目的就是構(gòu)建甘露聚糖酶的工程酵母來高效表達(dá)甘露

2、聚糖酶，以解決目前甘露聚糖酶產(chǎn)量低、成本高等問題，同時(shí)也為生產(chǎn)甘露寡糖提供有效的解決途徑。 本文利用畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)甘露聚糖酶(mannanase)。首先將man1克隆到畢赤酵母穿梭表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-man1，經(jīng)SacⅠ線性化酶切，PEG將其整合到畢赤酵母GS115(His-Mut+)染色體上，利用MM、MD平板篩選His+Muts型陽性克隆，在含不同濃度G418-YP

3、D平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。共篩選28株陽性克隆，將篩選到1株高拷貝菌株進(jìn)行5L發(fā)酵罐優(yōu)化表達(dá)研究，經(jīng)測定蛋白分泌量達(dá)1.5mg/mL。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，重組目標(biāo)蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到總蛋白的90％以上；相對分子質(zhì)量為66KD，較理論設(shè)計(jì)值大，分析是因目標(biāo)蛋白發(fā)生糖基化所致。該重組轉(zhuǎn)化子RMAN23遺傳穩(wěn)定性良好。甘露聚糖酶活性測定結(jié)果為250IU/mL(刺槐豆膠為底物)和470IU/mL(魔芋為底物)。通過酶學(xué)性質(zhì)研究該酶反應(yīng)