里氏木霉xyn-2基因在畢赤酵母中的表達及應用研究.pdf

1、木聚糖酶（1，4-β-D-xylanxylanohydrlase，EC3.2.1.8）通過內(nèi)切方式水解木聚糖分子中的β-1，4-木糖苷鍵，水解產(chǎn)物以木二糖和木三糖為主，及少量的木糖和阿拉伯糖。以木二糖、木三糖為主的低聚木糖以其良好的低熱性、穩(wěn)定性、保濕性、雙歧桿菌增殖作用等保健作用廣泛應用于食品領域。目前，低聚木糖主要通過酶法降解木聚糖制備。篩選和制備高活性和高底物特異性的木聚糖酶組分，以獲得二糖、三糖比例高，單糖比例低的水解產(chǎn)物是生產(chǎn)

2、低聚木糖的技術(shù)關(guān)鍵。傳統(tǒng)的方法是通過菌種篩選和發(fā)酵控制獲得高木聚糖內(nèi)切酶活性、低木糖苷酶活性的木聚糖酶，但是結(jié)果不夠理想。采用基因工程手段表達木聚糖酶將是解決這一問題的有效手段。
　　 本文以實驗室前期構(gòu)建的pPIC9-xyn2載體為基礎，從啟動子和信號肽的替換入手，構(gòu)建新型的表達載體，為木聚糖酶在畢赤酵母中的安全高效分泌表達探討新的方法，并對重組木聚糖酶的酶學性質(zhì)、搖瓶發(fā)酵條件和酶解產(chǎn)物進行了研究，以期為重組木聚糖酶的應用提供

3、參考。研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.構(gòu)建新型表達載體以pPIC9-xyn2載體為基礎，從啟動子和信號肽的替換和改造入手，設計和構(gòu)建了畢赤酵母表達載體pGAPHα-xyn2、pGAPRHα-xyn2、pGAPHINU-xyn2、pGAPHαM-xyn2、pGAPHαE-xyn2。在這一系列載體中，xyn2均由GAP啟動子調(diào)控，引導外源蛋白分泌表達的信號肽分別為釀酒酵母的α-Factor信號肽、菊粉酶基因信號肽INU以及優(yōu)化設計的

4、α-Factor信號肽，在后兩個載體中則加入了增強子。
　　 2.木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達以畢赤酵母菌株GS115為受體菌，采用電擊轉(zhuǎn)化法分別將表達載體pGAPHα-xyn2、pGAPRHα-xyn2、pGAPHINU-xyn2、pGAPHαM-xyn2、pGAPHαE-xyn2轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得畢赤酵母重組轉(zhuǎn)化子。隨機挑取轉(zhuǎn)化子，于YPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)72h后，DNS法測定酶活，各重組菌株的酶活依次為92IU/ml、1

5、04IU/ml、85IU/ml、168IU/ml、128IU/ml。結(jié)果表明，GAP啟動動子能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的表達，INU信號肽和改造后的α-Factor信號肽均能夠引導外源蛋白的分泌，增強子能夠起到增強GAP啟動子的作用。SDS-PAGE分析表明，重組木聚糖酶的分子大小約為21Kda。
　　 3.重組木聚糖酶酶學性質(zhì)的研究將木聚糖酶分別置于不同的溫度、pH、陽離子等條件下，研究木聚糖酶的最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性

6、、以及金屬離子對木聚糖酶活性的影響。結(jié)果表明，木聚糖酶作用的最適溫度為50℃，最適pH為5.0，熱穩(wěn)定性為60℃以下穩(wěn)定性較高，以上穩(wěn)定性很差，酸堿穩(wěn)定性為pH7以下時穩(wěn)定性較高，7以上很差，到9則失活，金屬離子的影響為Fe2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+對木聚糖酶的酶活力有不同的促進作用，Mn2+對木聚糖酶的酶活力則有抑制作用。
　　 4.畢赤酵母重組菌搖瓶發(fā)酵條件的研究將重組菌GS115/pGAPHα-xyn2分

7、別置于不同的條件下培養(yǎng)，探討pH、溫度、裝液量、培養(yǎng)時間、triton、EDTA對酶產(chǎn)量的影響，確定適合重組菌搖瓶發(fā)酵的條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。結(jié)果表明，重組菌在以下的條件下發(fā)酵較為理想：初始pH為5.0，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為120h，裝液量為250ml裝75ml，Triton添加量為0.01％或EDTA添加量為5mM。在此條件下，重組菌的發(fā)酵酶活可達165IU/ml或153IU/ml。
　　 5.木聚糖酶的酶解產(chǎn)物