康氏木霉纖維素酶CBHⅠ基因克隆及在畢赤酵母中的表達.pdf

1、纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種有機化合物，占植物干重的1/3～1/2，是世界總量最大的可再生資源，合理地開發(fā)與利用纖維素資源對于緩解能源危機、糧食短缺、環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義。利用微生物及其產(chǎn)生的纖維素酶來分解纖維素是一種有效且無污染的方法。纖維素酶是降解纖維素的高活性生物催化劑，廣泛用于飼料、環(huán)保、食品、釀酒、紡織、造紙等領域。但天然的微生物生產(chǎn)纖維素酶存在酶產(chǎn)量低、活性低、受到葡萄糖等產(chǎn)物的反饋抑制等許多問題，這

2、些問題極大地影響了纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)。應用基因工程技術來獲得高活力、高產(chǎn)量的纖維素酶資源越來越受到人們的重視。
　　 纖維素外切酶是纖維素水解酶系中唯一可以作用于結晶纖維素的酶組分，對纖維素的降解有著重要的作用。本實驗從纖維素酶高產(chǎn)菌康氏木霉(Trichodermakoningii)的染色體DNA中擴增得到外切葡聚糖酶CBHⅠ基因，構建重組表達質粒pGAPZαA-CBHⅠ并通過高壓電擊手段轉入到畢赤酵母(Pichiapasto

3、ris)X-33中實現(xiàn)了CBHⅠ基因在畢赤酵母中的表達。
　　 主要內(nèi)容包括以下：
　　 采用PCR技術擴增得到CBHⅠ基因，與克隆載體PMD19-T連接后轉入大腸桿菌DH5α，測序及序列比對結果顯示該DNA序列全長1626bp，與Genbank已公布的Trichodermaviride(FJ871063.1)的同源性達到99.63％，推測其編碼的蛋白質含497個氨基酸，分子量約為52.29kDa，蛋白質等電點pI=4.

4、28。
　　 將CBHⅠ基因與表達載體pGAPZαA連接后，通過過渡宿主大腸桿菌再轉化到畢赤酵母X-33中，將經(jīng)過鑒定的重組酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，定時取樣進行纖維素酶活性測定與SDS-PAGE蛋白電泳檢測，并對其產(chǎn)酶性質進行分析。結果顯示：重組酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)液羧甲基纖維素酶活力最高達到1.1798U/mL，微晶纖維素酶活力最高達到0.1276U/mL，SDS-PAGE蛋白電泳顯示表達蛋白的分子量約為53kDa。結果表明