酵母異源表達瑞氏木霉纖維素酶特性研究.pdf

1、乙醇最有發(fā)展前景的可再生液體燃料。面對世界人口的急劇膨脹和糧食短缺，用糧食生產(chǎn)酒精的發(fā)展將受到限制。近年來，利用重組酵母直接生物轉化纖維素生成酒精，由于其工藝設備簡單、成本低而被認為具有良好的發(fā)展前景，并成為世界各國近年來重點研究的方向。
　　 酵母由于其轉化和表達的高效性是一種良好的異源表達宿主，許多來源于真菌的纖維素酶已經(jīng)被表達于釀酒酵母中，并獲得了具有活性的重組酶蛋白。然而酵母表達外源纖維素酶基因的水平非常有限，酶活也存在

2、較大幅度的下降。其中，纖維素酶系的主要組分之一Ce17A(占瑞氏木霉分泌纖維素酶60％的質量分數(shù)，為作用于纖維素結晶區(qū)的關鍵酶)，在釀酒酵母和畢赤氏酵母中的表達被發(fā)現(xiàn)是高度糖基化的，有的沒有活性(Hong J et al.2003)，有的較野生型酶的酶活有較大程度的下降(Lynd LR et al.2002；Godbole S et al.1999；Boer H et al.2000)。而纖維素酶酶系中重要的內切酶Ce15A，在酵母中異

3、源表達，表達量較其來源的瑞氏木霉，存在著大幅度的下降(肖志狀等2001)。
　　 本文通過瑞氏木霉纖維素外切酶Ce17A的四個N-糖基化位點突變子分別在畢赤氏酵母的表達，比較研究了Ce17A高糖基化對酶在酵母中表達酶活力的影響，并得到Ce17A異源表達酶活提高的突變體酶；構建了釀酒酵母致突變菌，并將表達有瑞氏木霉纖維素內切酶Ce15A的釀酒酵母致突變菌進行定向篩選，得到了纖維素酶內切酶Ce15A異源酶表達量提高的突變菌株。這不僅

4、提高了纖維素酶在酵母宿主中的異源表達的酶活和酶表達量，也為蛋白質在酵母中的蛋白工程改造提供了有用的信息與平臺。
　　 本論文的主要研究成果如下：
　　 1. Ce17A在畢赤氏酵母中異源表達N-糖基化的研究。
　　 通過點突變對Ce17A的N-糖基化位點進行改造，將45、64、270和384位四個N—糖基化位點的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸，構建重組質粒并將其在p.pastoris中進行表達，獲得單獨表達外切纖維素酶的酵

5、母菌株，以此來研究高糖基化對Ce17A在酵母表達中的影響。研究證明，Asn64位的糖基化對畢赤酵母中表達的Cel7A酶活力影響較大，此位點的突變使rCe17A的酶活提高了7倍。對Ce17A及其四個N一糖基化位點的三級結構進行分析，結果表明Asn64基本上處于蛋白內部，殘基周圍可容納糖基化的空間很小。Asn64殘基若要被糖基化，至少會顯著改變局部結構，甚至可能影響整體結構和酶活。另外，rCe17A N64S突變體的酶活仍然遠低于野生型，這

6、說明Asn64位的糖基化可能只是影響Ce17A在畢赤酵母中表達后活性的一個方面。蛋白質折疊機制的差異和共翻譯糖基化對Ce17A二硫鍵和tunnel結構的形成具有重要影響。
　　 2.致突變菌的構建和Ce1SA高表達突變子的獲得。
　　 成功通過ctt1，sod1,Srx1三個氧化損傷清除基因的敲除，構建了三株致突變菌株，RDKY3615(△CTT)、RDKY3615(△SOD)和RDKY3615(△SRX)，測定了致突變

7、菌的生長情況和對H2O2的敏感性，并通過報告質粒中kanamycin抗性基因的回復突變，確定了H2O2濃度和處理時間對突變率的影響。將Ce15A在致突變菌RDKY3615(△CTT)和RDKY3615(△SOD)中表達，經(jīng)雙氧水處理和大量的CMC雙層平板篩選，獲得了一系列大水解圈突變株。經(jīng)過液體發(fā)酵和上清液總酶活的測定，篩選出15株酶活較野生型明顯提高的菌株，其中RDKY3615(△CTT)-Ce15A突變株11株，RDKY3615(△