調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)提高里氏木霉纖維素酶分泌的研究.pdf

1、里氏木霉是目前最常用的纖維素酶生產(chǎn)菌，不僅有強(qiáng)大的蛋白表達(dá)能力，而且其分泌的纖維素酶屬于胞外酶，有利于減少工業(yè)應(yīng)用成本。但野生菌株的產(chǎn)酶能力很弱，往往達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)要求。因此，需要對里氏木霉進(jìn)行性狀改良已期獲得可以進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的菌株。
　　本研究首先嘗試使用RNAi技術(shù)對里氏木霉轉(zhuǎn)錄抑制因子cre1基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制。選取 TU6ΔKU70里氏木霉菌株為研究對象，該菌株在原有 TU6菌株的基礎(chǔ)上敲除控制非同源重組的ku70基因，提高

2、外源基因同源重組效率。通過PCR，從里氏木霉的基因組中擴(kuò)增獲得目的片段：cbh1啟動(dòng)子、反向的cre1基因片段（568-963 bp）、正向的cre1基因片段（655~961 bp）和cbh2終止子。以pRS424為載體質(zhì)粒，利用DNA assembler方法成功構(gòu)建pCre1-i質(zhì)粒。再將RNAi盒分作兩個(gè)片段擴(kuò)增，同時(shí)轉(zhuǎn)化里氏木霉獲得5個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子。搖瓶發(fā)酵顯示其中一株轉(zhuǎn)化子在纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4.5d后，其纖維素酶的濾紙酶活較

3、出發(fā)菌株提高了30％。通過實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化子中cre1基因的轉(zhuǎn)錄水平比出發(fā)菌株降低了43%。
　　在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了共同調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子及轉(zhuǎn)錄抑制因子對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響。本文選取轉(zhuǎn)錄激活因子xyr1及轉(zhuǎn)錄抑制因子cre1基因，在上述RNAi干擾cre1基因同時(shí)選擇強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)xyr1基因表達(dá)，用同樣方法轉(zhuǎn)化里氏木霉TU6ΔKU70菌株，共獲得4個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子。纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)196 h，各轉(zhuǎn)化子纖維素