利用可溶性誘導(dǎo)物批式流加發(fā)酵培養(yǎng)里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶.pdf

1、基于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源生產(chǎn)的生物燃料和生物基化學(xué)品具有可再生和環(huán)境友好的優(yōu)點，對經(jīng)濟和社會可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。這類生物質(zhì)的生物煉制主要包括預(yù)處理、纖維素酶生產(chǎn)、纖維素組分酶解糖化和微生物發(fā)酵等單元操作及這些操作單元的系統(tǒng)集成和優(yōu)化，而纖維素酶成本高是制約生物煉制產(chǎn)業(yè)化技術(shù)開發(fā)的瓶頸之一。里氏木霉（Trichoderma reesei）是纖維素酶高產(chǎn)菌株，但該菌株纖維素酶合成需要誘導(dǎo)。纖維素是T.reesei纖維素酶合成的天然誘導(dǎo)

2、物，以微晶纖維素最有效，盡管其價格昂貴。然而，纖維素是不溶性的，需要依靠菌株低水平本底纖維素酶緩慢水解釋放出真正誘導(dǎo)物才能誘導(dǎo)纖維素酶大量合成，這一過程顯著延長了纖維素酶發(fā)酵時間，相應(yīng)降低了發(fā)酵罐纖維素酶生產(chǎn)強度。由于T.reesei液體深層發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶為高粘度非牛頓型流體且強好氧過程，生產(chǎn)強度低導(dǎo)致纖維素酶發(fā)酵過程攪拌和通風(fēng)的能耗成本極高。使用預(yù)處理后的秸稈、蔗渣及紙漿等廉價纖維質(zhì)原料作為誘導(dǎo)物，雖然可以解決微晶纖維素等成本高的問

3、題，但菌株本底纖維素酶水解這類纖維質(zhì)原料的效率極低，導(dǎo)致誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶效果非常差，纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)的能耗成本更高。可溶性誘導(dǎo)物可以被菌株直接利用，預(yù)期可以有效解決纖維素類誘導(dǎo)物存在的突出問題，然而目前開發(fā)的乳糖等可溶誘導(dǎo)物不僅成本較高，而且纖維素酶誘導(dǎo)效果差。本研究合成了低成本高效可溶誘導(dǎo)物，在此基礎(chǔ)上以T.reesei Rut C30為模式菌株，對纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)、纖維素酶系改造優(yōu)化以及原位生產(chǎn)的粗酶水解預(yù)處理后秸稈等過程進(jìn)行了研究

4、。主要內(nèi)容包括：
　　⑴以葡萄糖為底物，利用β-葡萄糖苷酶催化的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，制備含(β)二糖的可溶誘導(dǎo)物。轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)特點使反應(yīng)結(jié)束時殘留大量葡萄糖，這種葡萄糖和(β)二糖混合物(MGD)，可以更好促進(jìn)菌絲生長，同時高效誘導(dǎo)纖維素酶合成。此外，還選擇并研究了β-1，3-葡聚糖對T.reesei生長和纖維素酶合成的誘導(dǎo)效果。搖瓶實驗結(jié)果表明MGD和β-1，3-葡聚糖更容易被菌體利用，誘導(dǎo)纖維素酶合成能力分別是乳糖的1.16倍和1.24

5、倍，纖維素酶關(guān)鍵組分基因表達(dá)分析進(jìn)一步驗證了這些實驗結(jié)果。雖然MGD和β-1，3-葡聚糖誘導(dǎo)里氏木酶產(chǎn)纖維素酶效果相近，但是MGD成本較低。利用離子色譜分析了MGD的組成，發(fā)現(xiàn)二糖類誘導(dǎo)物主要為龍膽二糖、纖維二糖和槐糖，其中槐糖起最主要誘導(dǎo)作用。比較了酸水解甜菊糖苷制備槐糖和β-葡萄糖苷酶催化轉(zhuǎn)化葡萄糖制備MGD，與酸水解甜菊糖苷相比，β-葡萄糖苷酶催化轉(zhuǎn)化葡萄糖制備MGD在成本以及過程重復(fù)性上都有優(yōu)勢，而且無論是使用商業(yè)β-葡萄糖苷酶

6、還是自制β-葡萄糖苷酶，其催化轉(zhuǎn)化高濃度葡萄糖生成的MGD，均能高效誘導(dǎo)里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶。
　?、埔訫GD為誘導(dǎo)物，在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層培養(yǎng)T.reesei Rut C30生產(chǎn)纖維素酶。為避免MGD中高濃度葡萄糖對里氏木霉合成纖維素酶的抑制，開發(fā)了基于控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度流加MGD進(jìn)行補料的策略，葡萄糖濃度控制為0.05-0.30 g/L。實驗結(jié)果表明，發(fā)酵時間144 h時，纖維素酶活達(dá)到90.4 FPU/mL，比報道

7、的乳糖誘導(dǎo)纖維素酶酶活水平高10倍以上，纖維素酶生產(chǎn)強度高達(dá)627.1 FPU/L/h，是目前報道T.reesei生產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)強度的3-5倍。為了評價MGD誘導(dǎo)的纖維素酶(Cel-MGD)，測定兩種纖維素酶的比酶活并利用分泌蛋白組學(xué)分析對比了Cel-MGD與堿預(yù)處理后玉米秸稈(APCS)作為誘導(dǎo)物生產(chǎn)纖維素酶(Cel-APCS)的蛋白組成，結(jié)果表明Cel-MGD誘導(dǎo)的纖維素酶和β-葡萄糖苷酶比酶活分別提高1.74倍和2.42倍，但C

8、el-MGD中仍嚴(yán)重缺乏β-葡萄糖苷酶，而Cel-APCS含有更高的木聚糖酶活和纖維素降解輔助蛋白。
　?、菫榱藦浹aCel-MGD中嚴(yán)重缺乏β-葡萄糖苷酶的缺陷，構(gòu)建了組成型強啟動子Ppdc1高效過表達(dá)外源β-葡萄糖苷酶基因aabgl1的表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入T.reesei Rut C30，轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力普遍提高。利用產(chǎn)葡萄糖苷酶最高的重組菌T.reesei PB3分批補料發(fā)酵生產(chǎn)纖維素

9、酶，156 h纖維酶活超過50 FPU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活超過310 CBU/mL，比宿主菌β-葡萄糖苷酶酶活提高約70倍。該重組酶命名為Cel-MGD2，其與補加商品β-葡萄糖苷酶的Cel-MGD水解15％(w/v) APCS性能無顯著差別，葡萄糖收率均超過92％，發(fā)酵過程乙醇濃度超過44.0g/L。提高APCS的濃度到20％(w/v)，利用Cel-MGD2進(jìn)行分步糖化發(fā)酵(SHF)和同步糖化發(fā)酵(SSF)生產(chǎn)乙醇，在SHF工藝

10、條件下發(fā)酵120h，終點乙醇濃度達(dá)到54.2g/L，而SSF條件下發(fā)酵96 h，終點乙醇濃度為52.1 g/L。雖然SSF過程產(chǎn)乙醇濃度略低，但乙醇生產(chǎn)強度顯著提高。這些結(jié)果表明改造后的重組酶不需要復(fù)配就可以用于預(yù)處理后秸稈類生物質(zhì)水解。
　?、葹閷崿F(xiàn)纖維素和半纖維素的綜合利用，在T.reesei Rut C30過表達(dá)同源外切纖維素酶基因cbh2構(gòu)建纖維素酶高產(chǎn)菌株，并以MGD和APCS混合誘導(dǎo)物提高纖維素酶中木聚糖酶活性，生產(chǎn)可

11、高效水解含有高濃度半纖維素原料的纖維素降解酶。優(yōu)化MGD和APCS比例后，通過分批補料，發(fā)酵60h時纖維素酶活達(dá)到7.17 FPU/mL，木聚糖酶活性達(dá)到577.55 IU/mL，該粗酶液比MGD或APCS單獨誘導(dǎo)的纖維素酶降解APCS的效果更好，而且粗酶液不需要進(jìn)行任何處理即直接進(jìn)行預(yù)處理后的秸稈水解，粗酶液提高溫度至50℃，批次加入APCS至20％，最終測定釋放122.5 g/L葡萄糖和40.21 g/L木糖，產(chǎn)糖效果高于已有報道。