康寧木霉纖維素酶發(fā)酵條件和CBH2基因表達研究.pdf

1、纖維素酶降解途徑是自然界中各類纖維素降解的最主要方法，而木霉是目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維素酶能力最強的微生物，自然界豐富的纖維素資源的降解和利用依賴于木霉類真菌。因此系統(tǒng)的研究木霉產(chǎn)纖維素酶的條件以及所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)是很有必要的，研究纖維素酶高產(chǎn)菌株康寧木霉(Trichoderma koningii)AS3.2774 產(chǎn)纖維素的條件及酶學(xué)性質(zhì)是本實驗的一個方面；另外，本實驗利用生物信息的手段對康寧木酶CBHⅡ基因翻譯和表達成蛋白質(zhì)的調(diào)控機理

2、進行研究；本實驗還將纖維素酶CBHⅡ基因的cDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達并純化得到纖維二糖水解酶。 研究康寧木霉AS3.2774產(chǎn)纖維素酶的最適發(fā)酵條件，包括固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵中各種影響產(chǎn)纖維素酶的因素，對各單因素進行了優(yōu)化，找到了最佳發(fā)酵產(chǎn)酶配比。通過對康寧木霉AS3.2774所產(chǎn)纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的研究，得到了該酶最適宜的作用環(huán)境。 康寧木霉纖維素酶為誘導(dǎo)酶，當(dāng)培養(yǎng)體系中纖維素的存在可以激發(fā)纖維素酶的產(chǎn)生，

3、當(dāng)體系中有葡萄糖時，纖維素酶系基因的轉(zhuǎn)錄和表達受到抑制。這一點從前面的酶學(xué)性質(zhì)研究中也可以看出。本實驗利用SignalP 軟件分析，預(yù)測并分析該酶蛋白的信號肽，為研究CBH Ⅱ基因的翻譯和表達調(diào)控機理打下了基礎(chǔ)。 最后依據(jù)劉昌雄克隆的木霉CBHⅡ基因cDNA序列，重新構(gòu)建PET-28a(+)原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在大腸桿菌BL21(DE3)中以IPTG誘導(dǎo)表達，以鎳離子螯合型瓊脂糖凝膠親和層析柱純化，獲得了純化的纖維二糖