表面展示表達纖維素酶的釀酒酵母發(fā)酵微晶纖維素生產乙醇.pdf

1、篩選高活性纖維素酶生產菌，構建新型高效的纖維素降解工程菌被認為是目前針對能源消耗、油價上漲、環(huán)境污染等一系列問題最有效的解決途徑之一。
　　 本研究結合剛果紅染色和酶活檢測的方法篩選得到一株可高效降解纖維素的菌株，形態(tài)學觀察、分類地位鑒定及核糖體-ITS序列分析結果表明，此菌株為長枝木霉，命名為長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)CD-6，于中國普通微生物菌種中心保存，保藏編號為CGMCC No.5

2、395。CMCase、FPA酶、木聚糖酶活檢測，最高酶活性分別為50.65IU/ml、105.09IU/ml、172.62IU/ml，結果表明該菌株不僅生長速度快且能在短時間內產生大量高活性纖維素酶，對不同天然纖維素底物均具有較高的降解能力。
　　 克隆了三種纖維素酶基因，分別為長枝木霉的外切葡聚糖酶基因cbhⅡ，里氏木霉的內切葡聚糖酶基因egⅢ和黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因bgl，并對基因序列進行同源性分析。構建真核表面展示載體

3、pYE-cbh、pYD-eg-bgl，轉化入釀酒酵母感受態(tài)細胞中構建表面展示纖維素酶的重組釀酒酵母菌株。
　　 對表達不同纖維素酶基因的重組酵母所產的纖維素酶進行活性檢測及酶學性質分析。重組菌株CEN-pYD-EG-BGL、CEN-pYED-CBH-EG-BGL內切葡聚糖酶活性檢測，最大值分別為304.68 IU/ml、426.79IU/ml。重組菌株CEN-pYE-CBH、CEN-pYD-EG-BGL、CEN-pYED-CBH

4、-EG-BGL的濾紙酶活性檢測，最大值分別為322.27IU/ml、293.86 IU/ml、294.69IU/ml。重組菌株CEN-pYED-CBH-EG-BGL所產重組酶的酶學性質分析表明，最適pH、最適反應溫度分別為5.0和50℃。穩(wěn)定性分析結果顯示，在pH4.0-10.0、溫度20℃-50℃范圍內均具有良好的穩(wěn)定性。
　　 利用重組釀酒酵母菌株CEN-pYE+pYD(對照)、CEN-pYE-CBH、CEN-pYD-EG-

5、BGL、CEN-pYED-CBH-EG-BGL降解利用微晶纖維素，結果顯示除對照菌株外均具有纖維素降解能力，菌株CEN-pYED-CBH-EG-BGL降解能力最強。重組菌株CEN-pYED-CBH-EG-BGL利用微晶纖維素厭氧發(fā)酵生產乙醇，乙醇最高濃度為2.63g/L，乙醇產量為0.3g/g(每消耗1克微晶纖維素所產乙醇質量)。
　　 以上結果表明，本研究所構建的表面展示三種纖維素酶的釀酒酵母菌株可以有效的直接利用微晶纖維素同