具有纖維素酶活性的釀酒酵母工程菌株構(gòu)建研究.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文具有纖維素酶活性的釀酒酵母工程菌株構(gòu)建研究姓名：丁新麗申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：汪天虹20040516—～些至奎蘭塑苧堂垡堡壅摘 要絲狀真菌瑞氏木霉( T r i c h o d e r m ar e e s e i ) 是目前發(fā)現(xiàn)的對纖維素降解最有效的菌種之～一。纖維素酶系含有三大類組分：內(nèi)切葡聚糖酶( e n d o g l u c a n a s e ．E G ) 、纖維二糖水解酶( c e l

2、 l o b i o h y d r o l a s e ，C B H ) 并t l 葡萄糖苷酶( g l u c o s i d a s e s ) ，不同的纖維素酶組分通過相互之間協(xié)同作用降解纖維素。纖維素酶的基因克隆及其在釀酒酵母中的高效表達(dá)對發(fā)酵工業(yè)尤其是啤酒生產(chǎn)具有重要意義。本論文把強(qiáng)力降解纖維素的瑞氏木霉的纖維素酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，構(gòu)建了能分泌纖維素酶、且在遺傳．_ } 二穩(wěn)定的釀酒酵母工程菌株。采用P C R 技術(shù)分離得

3、到了釀酒酵母的m e t l O 基因的啟動(dòng)子和終止子序列；將瑞氏木霉內(nèi)切纖維素酶I ( E G I ) c D N A 基因分別插入到酵母p g k l 和m e t l O 基因啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)建了具有不同拷貝數(shù)的e g l 表達(dá)分泌質(zhì)粒p R S 4 1 5 M E 、p R S 4 1 5 P E 和p R S 4 2 5 P E ，通過電轉(zhuǎn)化使重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室釀酒酵母菌株H 1 5 8 中，分別得到了3 株重組酵母H

4、 l m 、H l p 和H 2 p 。在3 株重組酵母中，重組內(nèi)切纖維素酶I 都能在酶自身信號(hào)肽序列引導(dǎo)下進(jìn)行分泌型表達(dá)。在Y P D 培養(yǎng)基中三株重組酵母生長速率大致相同，H l m 、H l p 與H 2 p 的胞外E G I 酶活力分別達(dá)到7 0 ．4 ，1 2 6 ．7 和1 2 5 ．0 U ／m l ，它們都能在一定程度上利用麥芽汁中的B 一葡聚糖，其利用程度分別比H 1 5 8 高出1 7 ．8 ％、2 4 - 3 ％和

5、2 7 ％。從瑞氏木霉c D N A 文庫中分離得到了瑞氏術(shù)霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶I( C B H I ) c D N A 基因，將該基因分別連接到釀酒酵母表達(dá)載體p A J 4 0 1 和p V T I O O _ U上，轉(zhuǎn)化釀酒酵母H 1 5 8 ，得到了表達(dá)c b h l 的重組酵母菌株H P C 和H A C 。H P C和H A C 胞外C B H I 酶活力分別為4 U ／L 和3 ．5 U ／L 。構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)c b

6、 h l 和e g l 的重組酵母菌株H M E P C ，比較了H M E P C 和H i m 對纖維素底物的降解情況，發(fā)現(xiàn)前者的濾紙酶活比后者提高了1 4 ．3 ％。由于高產(chǎn)纖維素酶的重組啤酒酵母菌株可以有效地水解麥芽汁中的B 一葡聚糖，使啤酒的濾過性和最終啤酒的質(zhì)量得到改善；而部分或完全消除啤酒酵母m e t l O 基因( 編碼釀酒酵母亞硫酸鹽還原酶的一個(gè)亞基) 的活性應(yīng)導(dǎo)致亞硫酸鹽積累，其結(jié)果可增強(qiáng)啤酒抗氧化的能力，同時(shí)增加