高效表達熱穩(wěn)定纖維素酶融合全的酵母工程菌構建.pdf

1、總所周知，纖維素是最廉價的可再生資源，它在全球上分布范圍廣、蘊藏量極其豐富，然而這種資源有很多不能被直接利用，從而成為了纖維素廢物。在我國幾乎所有的纖維素廢物（作物秸稈、廢紙、廢木料）不是白白燒掉就是直接丟棄。這種不科學的處理不但造成了數(shù)十億的直接經(jīng)濟損失，并且焚燒過程中產(chǎn)生的大量有害氣體等廢棄物對我們生存環(huán)境和生態(tài)造成了嚴重影響。由于纖維素的難降解的分子結構，這些纖維素廢物不能得到很好地再利用。纖維素酶雖然已經(jīng)應用在工業(yè)上，但是纖維素

2、酶的酶活力、最適溫度、最適PH值、pH的穩(wěn)定性能和熱穩(wěn)定性能等生物酶學指標仍然需要繼續(xù)提高才能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。熱穩(wěn)定纖維素酶的主要來源為嗜熱微生物，一般來說產(chǎn)生于嗜熱真菌的纖維素酶能夠在高溫下具較強穩(wěn)定性和較高活力，并且同中溫真菌產(chǎn)生的纖維素酶一樣一般含有多種組分。
　　本研究中從嗜熱子囊菌光孢變種（Thermoascusaurantiacusvar.levisporus）中克隆出eg(1)基因(GenBank登錄號為AY84

3、7014)和61f基因(GenBank登錄號為KF170230)，然后通過融合PCR的方法，構建融合蛋白表達載體，與真核表達載體pPIC9k相連后，轉化畢赤酵母GS1l5，篩選陽性克隆，甲醇誘導表達，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，純化表達產(chǎn)物，測定纖維素酶活性及特性，與原始酶單獨作用的酶活性做比較，篩選到纖維素酶活性最高的融合蛋白酵母工程菌株，命名為61F-EG1，該菌株所表達的酶具有很好的熱穩(wěn)定性。61F-EG1產(chǎn)生的酶蛋白分子量為58.8kDa，最