利用人工鋅指蛋白技術提高釀酒酵母乙酸耐性.pdf

1、乙酸是乙醇發(fā)酵的主要副產物之一，也是纖維質原料水解液中一種主要的發(fā)酵抑制物。當乙酸濃度高達一定程度時，釀酒酵母細胞活性、生物量積累以及糖的利用都受到明顯抑制，高濃度乙酸也會造成細胞程序性死亡，影響纖維素乙醇發(fā)酵效率。鋅指蛋白(Zinc Finger Protein，ZFP)在基因轉錄和翻譯過程中有著非常重要作用，可以同時調控多基因表達。對轉錄因子進行人工設計和改造得到的人工轉錄因子(Artificial TranscriptionFac

2、tor, ATF)，包括對人工鋅指區(qū)基序及其排列順序進行設計和改造得到的人工鋅指蛋白，已經被廣泛應用于基礎研究、藥物設計以及基因治療等領域，但是，利用人工鋅指蛋白改造工業(yè)微生物菌種方面的應用研究還不夠深入。
　　本文首先將含有人工鋅指蛋白編碼基因的人工轉錄因子表達載體文庫(ATFs)轉入實驗室酵母S288c中，篩選得到一株具有較強的乙酸耐受性的突變體，進一步分離得到與乙醇和乙酸耐性提高相關的人工轉錄因子表達載體pRS316-M01

3、。將pRS316-M01轉入工業(yè)釀酒酵母Sc4126，重組酵母轉化子的乙醇和乙酸耐受性有明顯提高。在5 g/L乙酸脅迫條件下，Sc4126-M01表現出延滯期縮短、葡萄糖消耗速率以及乙醇發(fā)酵速率加快的優(yōu)良性能，發(fā)酵后期碳源缺乏條件下，該菌株還可以利用培養(yǎng)基中的乙酸進行二次生長。
　　為了探究人工鋅指蛋白ZFP-M01提高酵母乙酸耐性機理，用不同濃度乙酸沖擊含有ZFP-M01編碼基因的菌株Sc4126-M01（以下簡稱鋅指菌）及含有

4、空載體的對照菌株，發(fā)現含有人工轉錄因子的鋅指菌Sc4126-M01具有更高過氧化氫酶(CAT)活力和較低的還原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值。在沒有乙酸存在時，鋅指菌具有較低超氧化物歧化酶(SOD)活力，乙酸沖擊后，其SOD酶的酶活也低于對照菌株。推測鋅指蛋白的表達使細胞具有更強的清除過氧化氫能力，能夠避免過氧化氫對細胞的傷害，保持細胞的穩(wěn)定性。
　　利用人工鋅指蛋白的保守結合位點，對釀酒酵母基因組序列進行了分

5、析，預測了可能受到ZFP-M01的調控的靶點基因。實時定量PCR(RT-qPCR)分析結果表明，在乙酸脅迫條件下，鋅指菌Sc4126-M01細胞中QDR3，IKS1和YFL040W基因表達發(fā)生明顯下調。將三個基因分別敲除后，QDR3基因敲除子表現出乙酸耐受性增強，IKS1基因敲除子在高濃度乙醇和乙酸沖擊后，存活率有明顯提高，而YFL040W具有更高氧化脅迫耐受性。對乙酸耐性提高的QDR3和IKS1突變體進行了進一步的液體發(fā)酵實驗，在不同