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1、傳統(tǒng)化石能源在使用過程中產(chǎn)生的一些污染顆粒和有害氣體會(huì)對(duì)自然環(huán)境造成嚴(yán)重污染。尋求可再生的清潔能源迫在眉睫,不僅關(guān)系著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,也關(guān)系著人類文明的傳承。清潔的燃料乙醇作為新興能源的代表成為學(xué)者研究的熱點(diǎn),也受到各國(guó)政府的重視。目前發(fā)酵法是生產(chǎn)燃料乙醇的主要方法,但是在發(fā)酵過程中出現(xiàn)一些比較棘手的難題,比如乙醇脅迫、染菌等問題直接影響了燃料乙醇的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。發(fā)酵過程中積累的乙醇能夠抑制釀酒酵母的生長(zhǎng),影響細(xì)胞正常的生理活動(dòng),降低
2、乙醇的最終產(chǎn)量。雖然釀酒酵母對(duì)發(fā)酵液中積累的乙醇有一定的耐受能力,但是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),乙醇濃度越來越高,對(duì)釀酒酵母的抑制程度加劇。高濃度乙醇脅迫能誘導(dǎo)多種脅迫反應(yīng),比如熱激蛋白的高效表達(dá)和海藻糖的大量積累等,這些保護(hù)物質(zhì)的增加有利于增強(qiáng)釀酒酵母的乙醇耐受能力。
本論文旨在通過將海藻糖合成關(guān)鍵基因與熱激蛋白合成關(guān)鍵基因在釀酒酵母細(xì)胞中共表達(dá),以提高釀酒酵母的乙醇耐受性。首先,對(duì)釀酒酵母在不同濃度(0%,5%,10%,15% v
3、/v)乙醇脅迫下的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞直徑和發(fā)酵液pH值進(jìn)行了測(cè)定與分析。在添加外源乙醇發(fā)酵過程中,釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝會(huì)受到不同程度的抑制,且抑制程度隨乙醇濃度升高而加劇。同時(shí),比較了釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖和麥角固醇在不同濃度乙醇培養(yǎng)下的含量差異,其中麥角固醇的含量隨乙醇濃度的升高而增加,在添加乙醇濃度為15%(v/v)時(shí)最高;海藻糖含量也隨著乙醇濃度升高而增加,在乙醇濃度為10%(v/v)時(shí)達(dá)到最大值。海藻糖含量和麥角固醇含量呈正相關(guān),說
4、明在乙醇脅迫下,兩者可能協(xié)同保護(hù)釀酒酵母細(xì)胞。此外,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)海藻糖和熱激蛋白代謝相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明海藻糖合成基因tps1、tps2、tps3、tsl1的表達(dá)量隨乙醇濃度升高而增加,海藻糖分解基因ath1和nth2的表達(dá)量隨乙醇濃度升高而減少,但乙醇卻促進(jìn)了海藻糖分解基因nth1的表達(dá);熱激蛋白hsp78、hsp82、hsp104、ssa1的表達(dá)量隨著乙醇濃度升高而增加。采用SPSS軟件對(duì)海藻糖和熱激蛋白的
5、合成基因進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果表明兩者呈正相關(guān)。
在此基礎(chǔ)上,選取海藻糖合成關(guān)鍵基因tps2與熱激蛋白104合成基因hsp104,對(duì)其進(jìn)行基因操作,以實(shí)現(xiàn)其在釀酒酵母細(xì)胞中的共表達(dá),從而提高釀酒酵母乙醇耐受性。對(duì)tps2和hsp104進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并通過雙酶切與質(zhì)粒pYSE2進(jìn)行連接,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BMTOP10中,篩選陽性克隆,測(cè)序結(jié)果顯示沒有突變,序列完全正確。tps2和hsp104與質(zhì)粒pYES2的基因重組完成
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