重組釀酒酵母木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究.pdf

1、D-木糖是自然界中含量?jī)H次于葡萄糖的碳水化合物，在全球化石能源日漸枯竭，環(huán)境污染日益嚴(yán)重形勢(shì)下，將木糖高效轉(zhuǎn)化為乙醇將對(duì)全球經(jīng)濟(jì)和環(huán)境產(chǎn)生巨大的影響。Saccharomyces cerevisiae在己糖發(fā)酵上具有天然的優(yōu)勢(shì)，但是S.serevisiae中不具備代謝木糖能力，因此構(gòu)建可以利用木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的木糖，并發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的菌株是解決該問(wèn)題的核心點(diǎn)。
　　 使用ADH1啟動(dòng)子表達(dá)P.stipitis的木糖還原酶基因XY

2、L1，使用PGK1啟動(dòng)子表達(dá)P.stipitis的木糖醇脫氫酶基因XYL2;使用PGK1啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)S.cerevisiae內(nèi)源的木酮糖激酶基因SYKS1，將這三個(gè)使用不同啟動(dòng)子修飾的基因整合到S.cerevisiae工業(yè)菌株KAM-2的URA3基因座位，此基因工程菌株LEK122具備基本的木糖代謝能力，并可以生產(chǎn)少量的乙醇，我們將此菌株經(jīng)過(guò)EMS誘變，以及分為三個(gè)階段的適應(yīng)性進(jìn)化篩選，分離出一株可以高效利用木糖作為單一碳源進(jìn)行發(fā)酵的菌

3、株LEK513，相比其出發(fā)菌株LEK122，最大比生長(zhǎng)速率提高4.09倍，木糖消耗能力提高4.75倍，乙醇產(chǎn)量提高3.62倍，乙醇產(chǎn)率提高2.46倍。目前大多采用直接誘變進(jìn)行篩選，或者直接利用進(jìn)化篩選獲得高效利用木糖發(fā)酵菌株，期待自發(fā)突變的產(chǎn)生而得到理想結(jié)果，而我們采用的策略是將重組DNA技術(shù)，隨機(jī)誘變技術(shù)和適應(yīng)性進(jìn)化篩選技術(shù)結(jié)合使用，誘變產(chǎn)生的遺傳背景的改變幾率增加，通過(guò)選擇性進(jìn)化篩選，可以使得具有優(yōu)勢(shì)的突變株的代謝通路更加吻合我們的

4、篩選目的，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明，該方法的篩選目的性更強(qiáng)，效率更高。
　　 非氧化PPP是S.cerevisiae代謝木糖一個(gè)關(guān)鍵限制條件，我們通過(guò)使用S.cerevisiae組成型強(qiáng)啟動(dòng)子將非氧化PPP途徑的四個(gè)基因（TAL1，TKL1，RKI1，RPE1）全部過(guò)表達(dá)，并通過(guò)Northem blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在轉(zhuǎn)錄水平，這個(gè)四個(gè)基因都得到了不同幅度的正向調(diào)控，由此構(gòu)建了新的解除了非氧化PPP限制的出發(fā)菌株。
　　 通過(guò)

5、Westem bolt實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們分析了一部分分子生物學(xué)常用的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子(ADH1啟動(dòng)子；HYT7 truncated啟動(dòng)子；PDC1啟動(dòng)子；PGK1啟動(dòng)子；TPI1啟動(dòng)子)在葡萄糖和木糖分別作為碳源時(shí)的調(diào)控表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培天津大學(xué)博士學(xué)位論文養(yǎng)基中碳源從葡萄糖轉(zhuǎn)為木糖時(shí)，這些啟動(dòng)子的調(diào)控表達(dá)能力均有所下降，但是下降的幅度不同，在木糖作為碳源是，其調(diào)控能力的絕對(duì)值比較中，ADH1和PGK1啟動(dòng)子下調(diào)較多，而HXT7 tu

6、uncated和TPI1啟動(dòng)子的調(diào)控能力還保持在一個(gè)較高的水平，由此我們?yōu)楹罄m(xù)實(shí)驗(yàn)提供了新的選擇，更換木糖代謝途徑關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子。
　　 使用TPI1啟動(dòng)子表達(dá)P.stipitis的XYL1，使用HXT7 truncated啟動(dòng)子表達(dá)P.stipitis的XYL2和S.cerevisiae的XKS1，將他們分別引入之前構(gòu)建的解除非氧化PPP限制的出發(fā)菌株中，穩(wěn)定整合到染色體非編碼空白區(qū)域，得到菌株LEK631。對(duì)比出發(fā)菌株和使

7、用ADH1和PGK1啟動(dòng)子表達(dá)木糖代謝通路基因的菌株LEK630，菌株LEK631具有非常顯著的代謝木糖能力和乙醇生產(chǎn)能力的提高。菌株LEK631的最大比生長(zhǎng)速率為0.158h-1，216h可以消耗掉50g/L木糖的96.8％，是LEK630的8.134倍乙醇產(chǎn)量為7.575g/L，是LEK630的7.2倍，由此看出，更換了在木糖中具備良好調(diào)控表達(dá)能力的啟動(dòng)子帶來(lái)了非常顯著的變化。
　　 使用融合PCR技術(shù)合成Piromyces