利用代謝工程、輔酶工程及酶工程構(gòu)建重組釀酒酵母木糖利用菌株以生產(chǎn)乙醇的研究.pdf

1、當(dāng)今世界石油能源日漸枯竭，而人類對(duì)于能源的需求又與日俱增。在這種情況下，生物乙醇作為一種無污染的可再生能源，成為了極具前途的燃料替代品之一。然而，利用玉米、高粱等富含六碳糖的谷物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的傳統(tǒng)方法，卻存在著與人爭(zhēng)糧的問題。同時(shí)，工業(yè)和農(nóng)業(yè)殘余物中存在大量富含木糖等五碳糖的木質(zhì)纖維素，研究如何把這些五碳糖高效的轉(zhuǎn)化為乙醇，對(duì)于解決能源以及環(huán)境問題都有著重要的意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)使用釀酒酵母Saccharomyces cer

2、evisiae作為模式生物進(jìn)行了一些木糖代謝方面的研究。首先，本研究使用RT-PCR的方法對(duì)S.cerevisiae中一些組成型啟動(dòng)子在木糖培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)量，選出了其中最強(qiáng)的4個(gè)啟動(dòng)子pHXT17，pTPI1，pFBA1，pCCW12，并使用這4個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子在不同程度上過表達(dá)來自畢赤酵母P.stipitis的木糖還原酶(XR)基因XYL1和木糖醇脫氫酶(XDH)基因XYL2以及S.cerevisiae內(nèi)源的木酮糖激酶基因XKS

3、1，構(gòu)建出兩株高通量的xR－XDH系統(tǒng)重組木糖代謝菌株KAM－3X(XYL1，XYL2，XKS1單啟動(dòng)子表達(dá))和KAM－6X(XYL1，XYL2，XKS1雙啟動(dòng)子表達(dá))，兩株菌均能在72h左右完全發(fā)酵50g/l的木糖，乙醇產(chǎn)率分別為0.280g/g和0.310g/g；同時(shí)菌株KAM－6X可以在96h內(nèi)消耗完100g/l的木糖，乙醇產(chǎn)率為0.34g/g，而KAM-3X在相同時(shí)間內(nèi)只能消耗75g/l的木糖，乙醇產(chǎn)率為0.32g/g。這說明，

4、隨著XYL1，XYL2，XKS1轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的增加，可以增加重組菌株的木糖消耗能力，部分降低木糖醇產(chǎn)率并提高乙醇產(chǎn)率，但是單純的增加轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度并沒有從根本上解決木糖醇積累的問題。因此，需要解決XR－XDH系統(tǒng)存在的輔酶不平衡問題，才能減少副產(chǎn)物木糖醇的積累從而進(jìn)一步增加乙醇產(chǎn)率。
　　 本研究對(duì)重組木糖發(fā)酵菌株KAM－6X進(jìn)行混合糖發(fā)酵性能測(cè)試，結(jié)果顯示絕大部分木糖的消耗總是在葡萄糖消耗完以后才開始，而且隨著混合糖中葡萄糖濃度的升高，

5、木糖消耗速率會(huì)越來越慢。經(jīng)過后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，證實(shí)這種抑制是由于葡萄糖發(fā)酵后產(chǎn)生的乙醇所致。
　　 為了解決由于XR－XDH系統(tǒng)造成的輔酶不平衡問題，本研究首先嘗試改變XR的輔酶偏好性。XR的2－2C12和K270R這兩種突變型，是有文獻(xiàn)報(bào)道的偏好NADH而不是NADPH的突變型，由于文獻(xiàn)中未給出實(shí)際發(fā)酵數(shù)據(jù)，因此本研究在菌株KAM－6X中引入了這兩種突變型并測(cè)量了實(shí)際發(fā)酵性能。結(jié)果顯示，2－2C12突變型嚴(yán)重影響了XR酶活，使其

6、基本無法轉(zhuǎn)化木糖；而K270R突變型雖然部分影響了XR酶活以及其木糖轉(zhuǎn)化速率，但是輔酶偏好性的轉(zhuǎn)變卻使KAM-6X(K270R)的木糖醇產(chǎn)率從KAM-6X的0.105g/g大幅降低到了0.026g/g，同時(shí)乙醇產(chǎn)率從0.297g/g提高到了0.312g/g。這證明了改變輔酶偏好性以降低副產(chǎn)物木糖醇的積累從而提高乙醇產(chǎn)率的可行性。此外，本研究直接針對(duì)輔酶系統(tǒng)本身進(jìn)行改造，向重組木糖發(fā)酵菌株KAM－3X中引入了釀酒酵母內(nèi)源的缺失了前導(dǎo)肽的N

7、ADH激酶POSS(－17)和來自乳酸乳球菌Lactococcus lactis的NADH氧化酶noxE，并測(cè)量了菌株的發(fā)酵性能。結(jié)果顯示，POS5(－17)的引入使得重組菌株的木糖醇產(chǎn)率與對(duì)照相比從0.177g/g上升到了0.298g/g，同時(shí)乙醇產(chǎn)率從0.271g/g下降到了0.213g/g，與預(yù)想的結(jié)果相反。而noxE的引入則使得重組菌株的木糖醇產(chǎn)率從0.191g/g大幅下降到了0.058g/g，下降達(dá)到69.93％；同時(shí)乙醇產(chǎn)率

8、從0.211g/g提高到了0.294g/g，增加了39.33％，達(dá)到了預(yù)期的設(shè)想。
　　 本研究通過易錯(cuò)PCR的方法獲得了來自Piromyces sp的木糖異構(gòu)酶基因(XI)的兩種突變型XImut5和XImut8，攜帶這兩種突變型XI的菌株，利用木糖的速度與對(duì)照相比，獲得了十分顯著的提高。對(duì)照KAM-2XKS(XI)只能在木糖培養(yǎng)基中極其緩慢的生長(zhǎng)，無法產(chǎn)生乙醇，而KAM－2XKS(XImut5)和KAM－2XKS(XImut8