利用代謝工程構(gòu)建D-甘露醇生產(chǎn)菌株.pdf

1、D-甘露醇(D-Mannitol)作為一種功能性糖醇，廣泛應用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)及化學工業(yè)等領域。近年來，利用重組微生物合成D-甘露醇的方法因其更加安全、環(huán)境友好及較高的特異性越來越受到重視。大腸桿菌(Escherichia coli)擁有最成熟的基因操作方法，并已被普遍接受作為生產(chǎn)生物基化學品的優(yōu)秀平臺，因此可以作為生物合成D-甘露醇的優(yōu)良宿主。
　　本研究從野生型大腸桿菌ATCC8739出發(fā)，將來自假腸膜明串珠菌Leucon

2、ostocpseudomesenteroides ATCC12291菌株的D-甘露醇脫氫酶基因與果糖轉(zhuǎn)運蛋白基因整合到大腸桿菌ATCC8739的染色體中，并失活其他的發(fā)酵途徑，構(gòu)建了一株遺傳穩(wěn)定的D-甘露醇生產(chǎn)菌株Mtl-002，D-甘露醇的產(chǎn)量達到1.15 mmol/L。在該菌株中失活大腸桿菌的磷酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，并使用半乳糖透性酶(Galactose permease，GalP)和果糖轉(zhuǎn)運蛋白(fructose transporter，

3、FupL)進行葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)運，獲得的菌株Mtl-003使用無機鹽培養(yǎng)基，以葡萄糖果糖作為混合碳源厭氧發(fā)酵6天，D-甘露醇的產(chǎn)量達到1.21 mmol/L。基于菌株Mtl-003中細胞生長和D-甘露醇合成的偶聯(lián)，進一步通過代謝進化技術(shù)提高細胞合成D-甘露醇的生產(chǎn)能力。經(jīng)過80代的馴化后得到的菌株Mtl-004，D-甘露醇產(chǎn)量達到4.4 mmol/L，D-甘露醇脫氫酶的酶活為0.38 U/mg pro，MDH的編碼基因內(nèi)部發(fā)生了突變D3

4、01Y(g901t)。為了進一步提高細胞對果糖的轉(zhuǎn)運能力，將調(diào)控后的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glucose facilitator，glf)基因整合到Mtl-004中獲得菌株Mtl-005，其發(fā)酵產(chǎn)D-甘露醇的量達到6.22 mmol/L。
　　之后，為了以葡萄糖為底物直接生產(chǎn)D-甘露醇，將來自米蘇里游動放線菌Actinoplanes missouriensis(DSM43046)中的葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase，口a