高產(chǎn)甘露醇明串珠菌中甘露醇脫氫酶的特性分析.pdf

1、甘露醇，學(xué)名己六醇，可作為甜味劑在飼料中廣泛應(yīng)用。生產(chǎn)甘露醇的方法主要有提取法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法、微生物發(fā)酵法等。微生物發(fā)酵法因其可以提高甘露醇的產(chǎn)率并且能避免山梨醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)生成
　　為甘露醇生產(chǎn)的主要趨勢。目前已經(jīng)報(bào)道了多種微生物具有產(chǎn)生甘露醇的能力，包括霉菌、酵母菌和細(xì)菌，其中異型發(fā)酵乳酸菌為主要產(chǎn)生菌。明串珠菌作為異型發(fā)酵乳酸菌的一種，其合成甘露醇的代謝途徑是在甘露醇脫氫酶的作用下催化果糖生成甘露醇。
　　為了

2、研究明串珠菌中甘露醇脫氫酶的特性，使其更好地應(yīng)用于甘露醇的生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)以假腸膜明串珠菌為研究菌株，從假腸膜明串珠菌中獲得甘露醇脫氫酶基因，并在大腸桿菌中獲得表達(dá)。結(jié)果顯示：以假腸膜明串珠菌基因組 DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出大量甘露醇脫氫酶目的基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為l017 bp。將重組質(zhì)粒 pETDuet-1-mdh轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21（DE3）進(jìn)行轉(zhuǎn)化并且通過SDS-PAGE分析重組蛋白是否成功表達(dá)，結(jié)果表明，蛋白表達(dá)的分子量約為

3、36.007 kDa，與期望的分子量大小一致，說明重組蛋白成功表達(dá)，且表達(dá)量較高。
　　為了優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)甘露醇脫氫酶基因表達(dá)的條件，試驗(yàn)以IPTG不同濃度、不同誘導(dǎo)時(shí)間和不同誘導(dǎo)溫度對(duì)重組甘露醇脫氫酶基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示：IPTG誘導(dǎo)甘露醇脫氫酶表達(dá)的最佳濃度為0.5 mM、最佳誘導(dǎo)時(shí)間為16 h、最佳誘導(dǎo)溫度為30℃。
　　為了進(jìn)一步了解甘露醇脫氫酶的特性，實(shí)驗(yàn)分別對(duì)甘露醇脫氫酶最適反應(yīng)溫度、pH，熱穩(wěn)定性以及化

4、學(xué)抑制劑進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示：甘露醇脫氫酶最適反應(yīng)溫度為30℃；最適反應(yīng)pH值為7；加入Ca2+、尿素會(huì)促進(jìn)酶反應(yīng)，提高酶活性，但差別不大；加入Fe2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Na+以及SDS酶活性受抑制，其中，Na+、SDS對(duì)酶活性的抑制作用較強(qiáng)；對(duì)酶在30℃-80℃熱處理10 min，其中，30℃、40℃處理后，酶活性損失25％左右，50℃酶活性損失32%，60℃酶活性損失47%、70℃處理后酶活性損失較嚴(yán)重，酶活性損失60