檸檬明串珠菌高產(chǎn)甘露醇途徑中果糖激酶特性的研究.pdf

1、檸檬明串珠菌是一種能夠利用甘露醇脫氫酶（MDH）將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇的乳酸菌。但是，由于檸檬明串珠菌代謝過程中所產(chǎn)生的果糖激酶（FRK）的特殊活性，使得果糖被磷酸化成果糖-6-磷酸（F-6-P），最終導(dǎo)致果糖部分流入磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑而造成底物果糖的消耗與浪費(fèi)，降低甘露醇的生成。
　　本研究的目的是分析編碼果糖激酶的基因，將其克隆，并在大腸桿菌 BL21（DE3）中進(jìn)行過表達(dá)，分析蛋白表達(dá)情況，探究酶的特性，為進(jìn)一步降低甚至阻斷果糖激酶

2、活性的研究提供理論依據(jù)。質(zhì)粒pETDuet-1用于DNA操作，E.coli Top10和E.coli BL21（DE3）菌株用于克隆和蛋白的表達(dá)。通過酶偶聯(lián)法測定F-6-P的形成來檢測酶活性，利用薄層層析法（TLC）和酶活性測定的方法來檢測果糖激酶的底物特異性，酶活性測定方法應(yīng)用于整個(gè)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果表明：
　　1、L. citreum KM20中有兩組基因表達(dá)果糖激酶，分別為 LCK_00357和LCK_01119。兩組基

3、因均可成功表達(dá)出果糖激酶，且均有活性。它們的開放閱讀框（ORF）分別為954 bp和867 bp，分別編碼317個(gè)氨基酸和228個(gè)氨基酸，相對分子量大小分別為34.9 kDa和31.3 kDa。
　　2、酶的比活力分別為85.11 U/mg（LCK_00357）和282.87 U/mg（LCK_01119）。
　　3、果糖激酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為50℃和pH7.5，熱穩(wěn)定性很低。
　　4、果糖激酶需要金屬 M

4、g2+才會(huì)表現(xiàn)活性。Ba2+、Co2+、Zn2+、Ca2+和尿素對LCK_01119基因所表達(dá)的果糖激酶活性影響不是很大；Ba2+、Zn2+、Ca2+部分抑制LCK_000357基因所表達(dá)的果糖激酶（FRK），兩酶均被10 mM SDS完全抑制。
　　5、以D-果糖和ATP為底物時(shí)果糖激酶表現(xiàn)出最大活性，且D-果糖為唯一碳水化合物底物。
　　6、以D-果糖為底物時(shí)，Km值分別為0.84 mM和1.41 mM（LCK_0035

5、7和LCK_01119）。以ATP為底物時(shí)，Km值分別為3.98 mM和3.57 mM（LCK_00357和 LCK_01119）。以 D-果糖為底物時(shí)，Vmax值分別為26.11μM/min和85.47μM/min（LCK_00357和LCK_01119）。以ATP為底物時(shí)，Vmax值分別為39.53μM/min和106.38μM/min（LCK_00357和LCK_01119）。
　　許多菌株被報(bào)道能夠產(chǎn)甘露醇，并且對于果糖激