釀酒酵母BY5419生產(chǎn)丙酮酸的定向進(jìn)化及輔酶工程改造.pdf

1、丙酮酸是生物體內(nèi)重要的代謝中間產(chǎn)物，參與機(jī)體糖類(lèi)代謝、酯類(lèi)代謝等，在細(xì)胞代謝過(guò)程中起著關(guān)鍵的樞紐性作用，聯(lián)系著己糖二磷酸酯途徑(HDP)與三羧酸循環(huán)(TCA)兩大循環(huán)，許多代謝途徑可以通過(guò)丙酮酸這一共同的中間產(chǎn)物而聯(lián)系起來(lái)。日常中，丙酮酸及丙酮酸鹽的用途極廣，它是一類(lèi)重要的有機(jī)化工中間體，可以用來(lái)合成多種化合物如氨基酸、維生素等；甚至可以用于生產(chǎn)殺菌劑、除草劑等；特別近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，丙酮酸鈣具有良好減肥效果，繼而其研究也越來(lái)越熱。丙酮酸

2、的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、生物催化法和生物發(fā)酵法。而常見(jiàn)的化學(xué)合成法，酶催化法合成具有原料難得、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本較高，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，合成的丙酮酸酸多為外消旋混合物等缺點(diǎn)，因此利用微生物法合成丙酮酸酸成為發(fā)展趨勢(shì)。
　　 釀酒酵母作為一種研究和應(yīng)用最為廣泛的真核微生物，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇具有極好的優(yōu)勢(shì)。在厭氧條件和溢出代謝情況下，經(jīng)糖酵解生成的丙酮酸幾乎全部或大部分流向生產(chǎn)乙醇的支路，從而產(chǎn)生乙醇的積累；同時(shí)酵母細(xì)胞具有較高的耐受性

3、，乙醇可以積累到較高濃度。通過(guò)合理利用產(chǎn)乙酵的代謝流向，將乙醇的代謝流引向丙酮酸的積累，為丙酮酸的生產(chǎn)提供了新的思路。利用酵母積累丙酮酸，首先要阻斷乙醇支路的第一個(gè)作用基因丙酮酸脫羧酶基因（由PDCl/5/6編碼），但是敲除DC l/5/6后，改變了細(xì)胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為：(i)缺陷型菌株在葡萄糖限制的恒化條件下，在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，需要添加少量的乙醇或乙酸等二碳底物才能生長(zhǎng)；(ii)在葡萄糖存在的基本培養(yǎng)

4、基上，分批培養(yǎng)時(shí)，即使添加二碳底物，PDC缺陷型酵母菌株也不能生長(zhǎng)。這就極大限制了PDC缺陷型酵母菌株代謝產(chǎn)丙酮酸的可利用性。
　　 針對(duì)PDC缺陷型酵母菌株，本文利用微生物細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性，酵母細(xì)胞通過(guò)自身的突變?nèi)缓蠼?jīng)過(guò)自然選擇作用，積累突變從而適應(yīng)環(huán)境的能力，通過(guò)在搖瓶中一開(kāi)始添加葡萄糖的情況下，通過(guò)二碳底物梯度減少的連續(xù)馴化培養(yǎng)，后期通過(guò)逐步增加葡萄糖濃度提高菌株高糖耐受性，篩選到一株可以較為正常生長(zhǎng)且積累丙酮酸的菌

5、株BY5419-Ao，并進(jìn)行初步發(fā)酵研究，確定了馴化菌株Ao的發(fā)酵條件，在優(yōu)化發(fā)酵條件下，丙酮酸可以積累到66.4g/L，產(chǎn)率為0.55gPyr/g Glc。馴化菌株雖然能在正常培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但仍極為緩慢，因而發(fā)酵周期相對(duì)較長(zhǎng)。
　　 為了解決馴化菌株生長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致的發(fā)酵周期長(zhǎng)的問(wèn)題，我們利用輔酶工程的手段進(jìn)一步對(duì)BY5419-Ao進(jìn)行了分子改造。釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)，微量輔酶因子的變化就可能同時(shí)影響細(xì)胞內(nèi)多個(gè)反應(yīng)，從而引起細(xì)胞整體代

6、謝的變化。酵母細(xì)胞代謝從葡萄糖到丙酮酸的過(guò)程，是氧化還原不平衡的，多余的NADH需要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重新氧化，但釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重新氧化NADH的能力十分有限。為緩解釀酒酵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的氧化還原壓力，可以引入外源的輔酶因子轉(zhuǎn)化蛋白，進(jìn)行輔酶因子的調(diào)控。本研究通過(guò)在馴化菌株BY5419-Ao中表達(dá)外源性的輔酶調(diào)節(jié)基因：來(lái)源于L.lactis NZ9000的NADH水合氧化酶基因(noxE)和來(lái)源于E.coli JM109的轉(zhuǎn)氫酶基因(udhA

7、)，來(lái)改善馴化菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況。考慮到輔酶調(diào)節(jié)的微量性，即輔酶濃度的細(xì)小變化就可能導(dǎo)致細(xì)胞整體代謝的變化，本文構(gòu)建noxE和udhA的系列啟動(dòng)子（GPD/GPD2/ADH1/TEF）的相關(guān)質(zhì)粒，并采用不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒，調(diào)控量表達(dá)noxE和udhA基因，分別引入釀酒酵母馴化菌株BY5419-Ao，然后進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)輔酶調(diào)節(jié)的作用，獲得了丙酮酸產(chǎn)量提高的酵母菌株：l AN-Ao(70.47g/L)，2TN-Ao(70.86g/L)，IG