代謝-定向進(jìn)化工程釀酒酵母優(yōu)化木糖代謝途徑生成乙醇.pdf

1、化石燃料儲量的迅速減少、全球變暖等來自能源與環(huán)境的壓力引發(fā)了世界范圍內(nèi)對可持續(xù)、可再生能源的追求。乙醇是一種安全、清潔的能源物質(zhì)，利用可再生木質(zhì)纖維素資源生物轉(zhuǎn)化制取乙醇的研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)，而木質(zhì)纖維水解后產(chǎn)生的戊糖如木糖的利用成為了該途徑工業(yè)化的制約因素。因此，尋找能夠高效利用木糖的菌株為本研究的重點(diǎn)。
　　釀酒酵母是一種非常安全的微生物菌種，在工業(yè)乙醇發(fā)酵過程中起到了非常重要的作用，野生的釀酒酵母不能天然利用木糖，因此需要引

2、入木糖代謝關(guān)鍵基因。本試驗(yàn)所用到的初始菌株是此前已經(jīng)進(jìn)行分子改造且定向進(jìn)化后的菌株E7，能夠利用木糖。為了達(dá)到在原有基礎(chǔ)上提高木糖的利用速率以及乙醇的產(chǎn)生速率及產(chǎn)量的目的，本課題主要對酵母菌進(jìn)行了以下的改造并得到了一些較好的結(jié)果:
　　(1)選擇木糖還原酶XR、木糖醇脫氫酶XDH、木酮糖激酶XK、轉(zhuǎn)醛酶TAL1、丙酮酸激酶PYK1這些木糖代謝限速酶以及木糖轉(zhuǎn)運(yùn)子mgt05195所對應(yīng)的基因作為被調(diào)控對象，然后選擇了4個(gè)常用組成型啟

3、動(dòng)以及4個(gè)HSP（熱激蛋白）啟動(dòng)予以及4個(gè)TCA（三羧酸）循環(huán)啟動(dòng)子與六個(gè)關(guān)鍵基因作了一些組合，利用golden gateassembly的方法連接起來，并采用共轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到酵母中，最終得到了17株菌株。首先對17株菌進(jìn)行初步的篩選，在80g/L葡萄糖與40g/L木糖以及3g/L乙酸的混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，用高效液相色譜檢測樣品中不同組分含量，選出目標(biāo)菌株1Z、6YH、12YH與初始菌株E7進(jìn)行整個(gè)發(fā)酵過程的對比，其中發(fā)酵效果最好

4、的1Z在36h、48h時(shí)木糖消耗量分別為33.2g/L、36.1g/L，乙醇產(chǎn)量分別為53.5g/L、55.1g/L，分別達(dá)到了理論產(chǎn)量的93.2％與93.6％。
　　(2)將含有外源乳酸克魯維酵母丙酮酸激酶基因的2z-e7表達(dá)簇轉(zhuǎn)入到E7中得到2Z，2Z在36h、48h的木糖消耗量分別為33.8g/L、36.9g/L，乙醇產(chǎn)量為52.1g/L、52.8g/L，分別達(dá)到了理論產(chǎn)量的91.8％與90.6％，相較于1Z發(fā)酵性能并沒有提

5、升，說明外源性丙酮酸激酶基因klPYK1并沒有發(fā)揮出其在體外實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)勢，沒有得到預(yù)期的結(jié)果。
　　(3)然后，將1z-e7表達(dá)簇轉(zhuǎn)入到1Z中，得到1Z1Z菌株，1Z1Z在36h、48h的木糖消耗量分別為33.2g/L、36.3g/L，乙醇產(chǎn)量分別為53.4g/L、55.3g/L，分別達(dá)到了理論產(chǎn)量的93.7％與94.5％，發(fā)酵性能相較1Z有一定提高。說明木糖代謝途徑關(guān)鍵基因拷貝數(shù)的增加有利于加快發(fā)酵進(jìn)程。
　　(4)此外，

6、E7是E5菌株定向進(jìn)化得來，E7在36h、48h分別比E5多消耗了13.5g/L、13.2g/L的木糖，多產(chǎn)出了11.3g/L、10.6g/L的乙醇。在48h時(shí)E5的乙醇產(chǎn)量達(dá)到了理論產(chǎn)量的81.1％，E7的為91.5％，E7比E5的提高了10.4％。說明定向進(jìn)化與分子改造相結(jié)合可以大大加快菌株木糖的代謝速率以及乙醇的產(chǎn)生速度
　　(5)對定向進(jìn)化后的二倍體A2進(jìn)行基因改造，轉(zhuǎn)入1z-e7、2z-e7表達(dá)簇，得到A21Z、A22Z