新型β—瓊膠酶工程菌株的構(gòu)建、重組表達(dá)及體外復(fù)性的研究.pdf

1、瓊膠酶(Agarase)是能夠降解瓊膠的水解酶，根據(jù)其作用方式不同，可以把瓊膠酶分為兩類：α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。α-瓊膠酶裂解瓊脂糖的α-1，3糖苷鍵，生成以3，6-內(nèi)醚-α-L半乳糖為還原性末端的的瓊寡糖系列；β-瓊膠酶裂解瓊脂糖的β—l，4糖苷鍵，生成以β-D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖系列。目前所發(fā)現(xiàn)的瓊膠酶中，大多數(shù)都是β-瓊膠酶，只有三種是α-瓊膠酶?，F(xiàn)今瓊膠酶已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)以及基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，其生理功能

2、越來越引起人們的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室已從一株假別單胞菌CY24(Pseudoalteromonas sp．CY24)中克隆了一個新型β-瓊膠酶AgaB，并且在E.coli中已重組表達(dá)了agaB基因。研究表明AgaB是一個結(jié)構(gòu)和功能全新的β-瓊膠酶，它屬于一個新的糖苷水解酶家族。AgaB不同于已報道的瓊膠酶(降解瓊脂糖的主要終產(chǎn)物是新瓊二糖、四糖或六糖)，它降解瓊脂糖的主要終產(chǎn)物是新瓊八糖和十糖，因此瓊膠酶AgaB將會在食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)

3、以及生物技術(shù)研究領(lǐng)域發(fā)揮更大的應(yīng)用潛力。 重組AgaB在pET24／BL21(DE3)的表達(dá)系統(tǒng)中大部分為不可溶的包涵體形式，只有少量可以分泌到發(fā)酵上清液，分泌到上清液中的目的蛋白需經(jīng)過硫酸銨沉淀、脫鹽、離子交換、疏水層析、分子篩等系列純化步驟，最終可以從lL發(fā)酵上清中分離得到2—3 mg純蛋白，鑒于AgaB在該表達(dá)系統(tǒng)中純化步驟多，誘導(dǎo)劑價格昂貴，耗時長(16小時)不利于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，本文采用了溫度控制型載體pBV220作

4、為表達(dá)載體，為了方便純化，分別在AgaB的N端和C端添加了六個組氨酸作為親和層析純化標(biāo)簽構(gòu)建了兩種重組子，經(jīng)過比較其在不同宿主中的表達(dá)量，選定BL21(DE3)為其宿主菌。重組AgaB在42℃誘導(dǎo)4小時即可達(dá)到最高表達(dá)量，主要以包涵體的形式存在。菌體經(jīng)過超聲破碎、Triton X-100、DOC洗滌后得到高純度的包涵體，包涵體用8molL<'-1>的尿素溶解，經(jīng)過鎳離子親合柱一步純化得到大于95％純度的目的蛋白，目的蛋白經(jīng)脈沖稀釋法進(jìn)行

5、復(fù)性，最終，從1L發(fā)酵液中得到了40mg活性蛋白，其中C端攜帶標(biāo)簽的重組蛋白的活力單位1600 U mg<'-1>(約占天然蛋白的30％)，N端攜帶標(biāo)簽的重組蛋白的活力單位可達(dá)2100 U mg<'-1>(約占天然蛋白的40％)。復(fù)性后的重組蛋白表現(xiàn)出與天然瓊膠酶相同的生物活性，降解瓊脂糖的終產(chǎn)物為新瓊八糖和十糖，最適作用溫度為40℃，最適PH值為PH6.0。本文建立了一個高效、廉價的瓊膠酶AgaB表達(dá)體系pBV220-agaB-BL2