預(yù)防仔豬腹瀉基因工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、河北師范大學(xué)碩士學(xué)位論文預(yù)防仔豬腹瀉基因工程菌株的構(gòu)建姓名：柏佳寧申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：趙寶華20060520河北師范大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文摘要由產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌引起的仔豬黃白痢和由魏氏梭菌引起的仔豬紅痢是影響豬體健康的常見疾病，可嚴(yán)重影響仔豬的存活率和出欄率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文采用微生物分離方法從欒城縣某養(yǎng)豬場(chǎng)患病仔豬的糞便中分離到致病性大腸桿菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化和分子生物學(xué)鑒定為產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌。

2、以此菌株為研究對(duì)象，根據(jù)G_cneBaIlk公布的豬源致病性大腸桿菌LTB基因全序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，以分離菌株的基因組為模板擴(kuò)增出u’B基因，序列分析表明與其它參考菌株M17873(豬源ETEc的LTB)序列同源性為100％。然后，利用定點(diǎn)突變技術(shù)將形成sTl分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸堿基進(jìn)行了突變，最后將突變的STl基因與LTB基因融合，定向克隆于原核表達(dá)載體pET28b中，得到了重組質(zhì)粒pBETST3LTB，轉(zhuǎn)化受體菌BL21(DE3)

3、，得到重組菌株BL2l(DE3)(pBETST3LTB)，該菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDSPAGE分析可見其表達(dá)的30KD特異蛋白條帶，經(jīng)sT和Ⅱ’ELIsA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，重組菌株表達(dá)的sTlLTB融合蛋白能夠被ST和LT單抗識(shí)別。從本實(shí)驗(yàn)室保存的預(yù)防仔豬紅痢的基因工程候選菌株的質(zhì)粒中擴(kuò)增出魏氏梭菌aD毒素保護(hù)性抗原基因，通過(guò)分子生物學(xué)手段構(gòu)建到STl—L1’B基因下游，得到了重組菌株BL21(DE3)(pBETST3LTB旺p)，該菌