枝狀枝孢霉MD2基因工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、紫杉醇是一種高效、低毒、廣譜的抗腫瘤藥物。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇是解決紫杉醇藥源緊缺問題的有效途徑之一。然而目前分離的大部分紫杉醇產(chǎn)生菌，其合成紫杉醇的產(chǎn)量都很低，尚無法進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。本研究希望通過基因工程技術(shù)對紫杉醇產(chǎn)生菌進行遺傳改造，構(gòu)建紫杉醇高產(chǎn)的基因工程菌株，為其產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。
　　 基于以上目的，本論文在已經(jīng)建立的根癌農(nóng)桿菌LBA4404 介導(dǎo)的產(chǎn)紫杉醇真菌枝狀枝孢霉MD2 遺傳轉(zhuǎn)化體

2、系的基礎(chǔ)上進行了以下研究：
　　 （1）從曼地亞紅豆杉細胞中克隆了紫杉醇合成途徑中的關(guān)鍵酶10-去乙酰巴卡亭III-10β-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（dbat）；
　　 （2）將dbat基因克隆到pBI121 質(zhì)粒上，替換掉gus基因，構(gòu)建了CaMV35S-dbat-Nos表達框，然后將35S-dbat-Nos表達框克隆到pCAMBIA1303 質(zhì)粒的多克隆位點，構(gòu)建了用于遺傳轉(zhuǎn)化的表達載體p1303-SdbatN，并采用電轉(zhuǎn)的方

3、法將p1303-SdbatN載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中；
　　 （3）以枝狀枝孢霉MD2的孢子為受體，采用根癌農(nóng)桿菌LBA4404 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將載體p1303-SdbatN 導(dǎo)入到枝狀枝孢霉MD2中，并在含有30 μg/mL 潮霉素和100 μg/mL 頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子；
　　 （4）隨機選擇6 株陽性轉(zhuǎn)化子，通過PCR擴增潮霉素抗性基因（hph）來檢測分析T-DNA的插入情況，結(jié)果表

4、明，6 株陽性轉(zhuǎn)化子均能擴增出hph基因條帶，這說明T-DNA已經(jīng)插入到枝狀枝孢霉MD2的基因組中。進一步通過Southern blot分析T-DNA在宿主基因組中的整合方式，結(jié)果表明：根癌農(nóng)桿菌LBA4404 介導(dǎo)的枝狀枝孢霉MD2的轉(zhuǎn)化多為單拷貝隨機插入；
　　 （5）通過Western blot和熒光檢測分析報告基因gfp的表達情況，結(jié)果表明，報告基因gfp在35S 啟動子的調(diào)控下能夠在枝狀枝孢霉MD2中得到表達；

5、　　 （6）將枝狀枝孢霉MD2 陽性轉(zhuǎn)化子接到不含潮霉素的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代后，再轉(zhuǎn)接到含有潮霉素的選擇培養(yǎng)基上，對轉(zhuǎn)化子進行遺傳穩(wěn)定性檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在無潮霉素選擇壓力的條件下，仍然保持潮霉素的抗性，說明T-DNA插入的穩(wěn)定性，也說明該轉(zhuǎn)化方法穩(wěn)定可靠；
　　 （7）通過HPLC 檢測陽性轉(zhuǎn)化子的紫杉醇產(chǎn)量，獲得1 株紫杉醇產(chǎn)量明顯提高的工程菌株，其紫杉醇產(chǎn)量為野生菌紫杉醇產(chǎn)量的3 倍。該研究工作為將來利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫