球孢白僵菌抗逆相關(guān)功能基因克隆與基因工程菌株構(gòu)建研究.pdf

1、蟲生真菌作為重要的天敵生物資源，具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其是其可貴的流行潛力始終吸引著人們。球孢白僵菌Beauveria bassiana（以下簡稱白僵菌）是害蟲微生物防治中一種經(jīng)典的絲孢類蟲生真菌，可侵染15個目149個科的700多種昆蟲和若干種蛛螨類。在自然界中它具有分布廣、感染力強和擴散流行的特點；同時也具有不污染環(huán)境，易于培養(yǎng)，以及防治效果好等優(yōu)點。因此白僵菌也是研究最多、應(yīng)用最廣和最具有開發(fā)潛力的蟲生真菌。然而，如同其他真菌殺蟲

2、劑一樣，球孢白僵菌因為擊倒害蟲時間長、防效不穩(wěn)定以及自身抗逆性較差等缺點，目前在農(nóng)藥市場上的占有率依然很低。為延長白僵菌孢子儲藏期，增強其環(huán)境穩(wěn)定性，有必要利用基因工程手段對其進行改造，以獲得適合市場需要的產(chǎn)品，促進其商品化生產(chǎn)和應(yīng)用。
　　 海藻糖是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的抗逆境劑，具有增強生物體對高溫、脫水、干旱、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒物質(zhì)等逆境的抵抗能力。胞內(nèi)海藻糖積累與絲狀真菌孢子的儲藏期延長密切相關(guān)。我們推測，通

3、過基因工程技術(shù)改變球孢白僵菌體內(nèi)海藻糖代謝途徑，可以提高孢子內(nèi)海藻糖含量，增加其抗逆能力。
　　 同樣，具有保護細胞功能的熱休克蛋白70是熱休克蛋白家族中最重要的一類家族成員。它的研究已成為目前生命科學領(lǐng)域研究的熱點之一。HSP70蛋白作為一種非特異性保護蛋白，能夠防止蛋白質(zhì)變性和幫助已變性的蛋白重新折疊，恢復(fù)正確的構(gòu)象，具有“分子伴侶”、細胞保護、抗凋亡等獨特復(fù)雜的生物學功能。因此，對于細胞的生存起著至關(guān)重要的作用。通過克隆球

4、孢白僵菌hsp70基因，并深入探討其表達規(guī)律和作用機理對蟲生真菌抗逆機制研究具有重要的意義。
　　 我們通過SMART RACE RT-PCR技術(shù)從球孢白僵菌Bb202菌株中克隆了海藻糖合成途徑中的兩個重要基因（海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因tps2）的cDNA序列（GenBank登錄號分別為：FJ769373和FJ769375）。并通過DNA步移技術(shù)獲得了它們各自的上游啟動子序列（GenBan

5、k登錄號：FJ769374，F(xiàn)J769376）。序列分析表明：球孢白僵菌tps1結(jié)構(gòu)基因含有一個長度為55bp的內(nèi)含子，位于結(jié)構(gòu)基因的313堿基至367堿基處。其cDNA全序列為1906bp。開放式閱讀框由1563個核苷酸組成，編碼520個氨基酸，成熟蛋白理論分子量為58.3kDa，理論等電點為5.63。5’非翻譯區(qū)（5’-UTR）與3’-非翻譯區(qū)（3-UTR）分別為112bp和263bp。在終止密碼子下游3’-UTR有polyA加尾信

6、號AATATA和有26 bp的polyA結(jié)構(gòu)。球孢白僵菌tps1基因上游序列的轉(zhuǎn)錄起始位點位于第2785位G堿基處。該上游序列含有TATA-box、GC-box，同時也存在其它多個潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。如：Oct-1結(jié)合位點，CRE-BP結(jié)合位點，CdxA結(jié)合位點以及可與Ⅳ型鋅指蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合的GATA元件等。球孢白僵菌tps2結(jié)構(gòu)基因含有兩個長度分別為140bp和62bp的內(nèi)含子。它們分別位于結(jié)構(gòu)基因的127堿基至266堿基處

7、和2209堿基至2270堿基處。它們均符合真核生物內(nèi)含子剪接位點5’-GT…AG-3’規(guī)則。tps2的cDNA全序列為3219bp。開放式閱讀框由2619個核苷酸組成，編碼872個氨基酸，成熟蛋白理論分子量為97.8kDa，理論等電點為6.32。5’非翻譯區(qū)（5'-UTR）與3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）分別為310bp和290bp。在終止密碼子下游含有28bp的polyA結(jié)構(gòu)。球孢白僵菌tps2基因上游序列的轉(zhuǎn)錄起始位點位于第4105

8、位C堿基處。該上游序列含有TATA-box、CAAT-box和GC-box，并且也存在其它多個潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。如：cap結(jié)合位點，Adf-1結(jié)合位點，Oct-1結(jié)合位點，C/EBP結(jié)合位點，CdxA結(jié)合位點等。其中可與Ⅳ型鋅指蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合的GXTA元件含量相當高。
　　 使用同樣方法，我們從球孢白僵菌中克隆出了完整的熱休克蛋白HSP70基因編碼區(qū)序列及上游序列。該基因cDNA全長2405bp，5’端非翻譯區(qū)17l

9、bp，3’端非翻譯區(qū)263bp，開放閱讀框（ORF）1971bp，編碼656個氨基酸。成熟蛋白理論分子量為71.3kDa，理論等電點為4.92。得到的上游序列長度3559bp，其中有305bp序列與cDNA序列重疊。分析表明，該上游序列的轉(zhuǎn)錄起始位點位于第3255位G堿基處，沒有明顯的TATA-box和CAAT-box，但含有CCAAT-binding factor、GC-box等重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，以及熱激應(yīng)答元件HSE和GATA

10、元件等啟動子順式調(diào)控元件。
　　 通過Realtime-PCR技術(shù)，我們對球孢白僵菌tps1和hsp70基因在高溫、低溫、紫外照射等不同脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄情況進行了檢測。從mRNA轉(zhuǎn)錄水平探討了不同脅迫條件對球孢白僵菌這兩個基因表達的影響。結(jié)果表明，球孢白僵菌菌絲與孢子中的tps1基因在三種脅迫下轉(zhuǎn)錄表達差異較小。而三種脅迫均能誘導(dǎo)球孢白僵菌熱休克蛋白基因hsp70的快速高效轉(zhuǎn)錄表達。說明球孢白僵菌中tps1與hsp70基因，對于

11、外界逆境影響，具有不同的應(yīng)答機制。
　　 將克隆得到的球孢白僵菌tps1基因連接到分泌性表達載體pVIC9K上后，通過電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)獲得了60kDa左右的表達蛋白，與預(yù)測的結(jié)果（58.3kDa）及相關(guān)報道結(jié)果接近。同時，酶活測定結(jié)果表明，表達蛋白具有海藻糖-6-磷酸合成酶生物活性，誘導(dǎo)的粗酶液酶活最高達到1.384U/ml。
　　 將克隆得到的球孢白僵菌tps1基因連接到含有構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘

12、油醛脫氫酶基因啟動子的載體pBARGPE1后，通過芽孢轉(zhuǎn)化，重新轉(zhuǎn)入球孢白僵菌中，對該基因進行組成型表達?？鼓嫘栽u價表明tps1基因的組成型表達，在低溫下可一定程度增強重組菌株的貯藏性能，相對于出發(fā)菌株，重組菌株的活孢率同比提高了約35％。在一定熱脅迫范圍內(nèi)，重組菌株耐熱性能也得到了提高，相對于出發(fā)菌株，重組菌株的活孢率同比提高了約30％。但重組菌株抗紫外能力并沒有增強。生物學特性觀測表明，重組工程菌株相對于出發(fā)菌落生長較慢，且產(chǎn)孢量降