球孢白僵菌高毒力菌株的篩選及其與小菜蛾互作相關基因的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、小菜蛾（Plutella xylostella）是一種世界性害蟲，主要危害十字花科植物。不僅危害嚴重，而且由于化學農(nóng)藥的大量使用，已發(fā)現(xiàn)該蟲對多種化學農(nóng)藥產(chǎn)生了較強的抗藥性。開發(fā)新型有效的生物農(nóng)藥是解決當前小菜蛾防治難題的有效途徑之一。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是當前研究和應用最廣泛的真菌類生物農(nóng)藥之一，篩選對小菜蛾具有高毒力的球孢白僵菌菌株，并分析球孢白僵菌與小菜蛾之間的互作相關基因，是進一步提高球孢白僵菌對小

2、菜蛾防治效果的重要基礎。
　　本研究首先通過對不同地區(qū)采集的球孢白僵菌菌株進行初步篩選，獲得對小菜蛾致病力最強的高毒力菌株。其次，以此高毒力菌株為研究對象，將純培養(yǎng)的球孢白僵菌、未受感染的小菜蛾幼蟲和球孢白僵菌侵染小菜蛾48h的蟲菌混合樣品分別進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選侵染及致病過程中真菌和昆蟲差異表達的基因，并分析相關基因的功能，探討球孢白僵菌與小菜蛾之間互作的相關基因，為球孢白僵菌菌株的基因改良奠定基礎。
　　主要研究結(jié)果如下

3、:
　　1.球孢白僵菌對小菜蛾高毒力菌株的篩選:
　　選擇分離自鱗翅目昆蟲的球孢白僵菌菌株20株，對小菜蛾2齡幼蟲進行生物測定，初步篩選出對小菜蛾2齡幼蟲毒力較強的菌株5株為Bb2393、Bb2391、Bb2361、Bb2356、Bb2345。進一步不同濃度孢子懸浮液生物測定結(jié)果表明5株菌株的半致死時間分別為4.59d、5.17d、5.38d、5.3d、5.5d，半致死濃度為1.48×105孢子/mL、3.10×105孢子/

4、mL、6.18×105孢子/mL、6.95×105孢子/mL、1.27×106孢子/mL。不同溫度條件下生物測定結(jié)果表明:Bb2393溫度適應性較強，在20℃和25℃兩個溫度條件下，25℃Bb2393的校正侵染率為88.69％，致死中時為4.32d。因此，篩選獲得的球孢白僵菌Bb2393菌株為防治小菜蛾的最適菌株。
　　2.球孢白僵菌侵染及致病相關基因分析:
　　轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，純培養(yǎng)的球孢白僵菌與侵染小菜蛾幼蟲48h的

5、球孢白僵菌轉(zhuǎn)錄組對比分析共得到8383個差異表達基因，其中顯著差異表達基因716個(FDR FDR≤0.001，log2Ratio≥1)，上調(diào)基因350個，下調(diào)基因366個。GO二級分類表明，DEGs被注釋到26個GO term中，包括11個生物學過程(biological processes)，8個細胞組分(cellular component)和7個分子功能（molecular function）。pathway分析表明:共有12個

6、Pathway(Pvaluetion)，93個上調(diào)基因和61個下調(diào)基因參與了這些途徑。深入分析DEGs發(fā)現(xiàn)，類幾丁質(zhì)蛋白(chitinase-like protein)、幾丁質(zhì)酶1(chitinase1)、酸性幾丁質(zhì)酶(acidic chitinase)、細胞壁半乳糖抗原蛋白(antigeniccell wall galactomannoprotein，putative)、胞外絲氨酸富集蛋白（extracellular serine-r

7、ich protein）等在侵染過程與毒力相關的基因均具有顯著性差異表達。另外我們還獲得了一些早期未見報道的可能與侵染相關的基因，這些基因在侵染過程中的作用有待進一步的驗證。
　　3.小菜蛾對抗球孢白僵菌的免疫相關基因分析:
　　以小菜蛾為對照，感染球孢白僵菌48h小菜蛾為處理組，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術分析其基因表達差異。通過分析得到15542個表達差異基因，其中顯著差異表達基因2434個（FDR≤0.001和log2Ratio

8、≥1），上調(diào)基因1080個，下調(diào)基因1354個。2434個基因?qū)儆谌齻€GO域（生物過程、細胞成分、分子功能）的45個不同功能組。KEGG結(jié)果顯示DEGs能夠匹配到298個代謝通路，其中富集較顯著的通路有25個(Pvalue≤0.05)。此外，還篩選到肽聚糖識別蛋白、酚氧化酶、絲氨酸蛋白酶等與免疫應答相關的基因、海藻糖酶等與能量代謝相關的基因和次級代謝產(chǎn)物相關基因。這些小菜蛾對抗球孢白僵菌免疫相關基因的發(fā)現(xiàn)，為進一步通過調(diào)控小菜蛾的免疫力