高毒力蘇云金桿菌菌株的篩選及基因型鑒定.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis簡稱Bt)是目前研究最深入、使用最廣泛的殺蟲微生物之一,但甜菜夜蛾對(duì)目前已發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)Bt菌株不敏感或低敏感,已商業(yè)化的蘇云金桿菌殺蟲劑對(duì)其效率很低.由于甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)近些年來在中國大面積頻繁爆發(fā)、猖獗成災(zāi),因此深入發(fā)掘中國豐富的蘇云金芽孢桿菌資源,篩選高毒力及特異性菌株,對(duì)其基因型進(jìn)行分析,其結(jié)果對(duì)微生物殺蟲劑的研制、構(gòu)建高效廣

2、譜工程微生物和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物都具有重要的理論及實(shí)踐意義.該研究從河北省境內(nèi)55個(gè)縣市采集土樣700份,采用醋酸鈉-抗生素分離法從中分離出蘇云金芽孢桿菌34株,對(duì)田間采集的自然死亡的蟲尸采用平板稀釋法分離到Bt菌株13株.以甜菜夜蛾、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera Hubner)、粘蟲(Mythimna separata Walker)、玉米螟(Ostrinia furnacalis(Hubner))和小菜蛾(Plu

3、tells xylostella(Linnaeus))的一齡幼蟲為試蟲進(jìn)行生物測定,從中篩選出11株對(duì)鱗翅目幼蟲具有高毒力的Bt菌株.經(jīng)復(fù)篩確定T4-3和CYZ-13兩株對(duì)甜菜夜蛾活性最好,且這兩株對(duì)鱗翅目幼蟲表現(xiàn)出廣譜性.以HD-1為標(biāo)準(zhǔn)菌株測定了兩株發(fā)酵液的致死中濃度(LC<,50>)分別為2.01×10<'6>cells/mL(T4-3)、1.50×10<'6>cells/mL(CYZ-13)和5.76×10<'6>cells/m

4、L(HD-1),結(jié)果表明兩株的毒力高于HD-1 2-3倍.隨后對(duì)兩菌株進(jìn)行了V.P反應(yīng)、水解電泳、蔗糖產(chǎn)酸、菌膜、纖維二糖產(chǎn)酸、甘露糖、水解七葉靈、解朊反應(yīng)、脲酶產(chǎn)酸和卵磷酯酶產(chǎn)生10項(xiàng)生化反應(yīng)指標(biāo)測定,結(jié)果表明Bt.T4-3的所有指標(biāo)同B.t.subsp.subtoxicus一致.Bt CYZ-13同Bt.subsp.kurstaki一致.用GT培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng),以HD-1為標(biāo)準(zhǔn)菌株測定T4-3和CYZ-13的生長曲線表明三種菌株生長曲

5、線及三種時(shí)期差異不顯著,這兩種菌株的實(shí)際發(fā)酵應(yīng)用中不用特殊處理.利用PCR-RFLP體系合成四對(duì)引物K5un2/K3un2,K5un3/K3un3,S5un2/S3un2,S5uni/S3uni,以T4-3和CYZ-13兩菌株的質(zhì)粒提取物為模板對(duì)四對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并分別采用限制性內(nèi)切酶Pst Ⅰ/Xbal,EcoR Ⅰ/Pst Ⅰ,Msp Ⅰ/Mva Ⅰ和Bsp119 Ⅰ/Ban Ⅰ對(duì)四對(duì)引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切,鑒定兩菌株的基