蘇云金桿菌武漢亞種140菌株的理化特性研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑之一。但Bt菌株普遍存在殺蟲(chóng)譜窄、作用效果緩慢等問(wèn)題，因此深入發(fā)掘我國(guó)豐富的微生物資源，研究其具有代表性的殺蟲(chóng)蛋白特性，為篩選高效廣譜的特異性菌株，對(duì)于殺蟲(chóng)微生物的推廣和使用、構(gòu)建高效廣譜的工程菌和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物都具有重要的理論和實(shí)踐意義。 本研究對(duì)Bt武漢亞種140(ssp.wuhanensis140)菌株進(jìn)行了

2、較為系統(tǒng)的殺蟲(chóng)晶體蛋白的特性研究。利用原子力顯微鏡對(duì)其晶體進(jìn)行了掃描觀察，其伴胞晶體有多種形態(tài)，存在有多邊形、近方形、不規(guī)則形等形態(tài)。 來(lái)自Btssp.wuhanensis140菌株的這些殺蟲(chóng)晶體蛋白，對(duì)斜紋夜蛾(Prodenialitura)有較強(qiáng)的毒力作用。晶體蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Heliothisarmigera)幼蟲(chóng)毒力稍弱，但可增強(qiáng)HD-1對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒力，并對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育有強(qiáng)烈的抑制作用。Btssp.wuhane

3、nsis140菌株晶體蛋白對(duì)HD-73增效作用不明顯。 經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，Btssp.wuhanensis140與HD-1菌株的SDS-PAGE電泳譜帶基本上一致，主要為135kD和60kD譜帶，Btssp.wuhanensis140菌株的60kD處譜帶分子量略小于HD-1，且表達(dá)量稍弱。這些蛋白帶從膠上切割下來(lái)后，經(jīng)胰蛋白酶降解后，用MALDI-ToF/ToF進(jìn)行分析，蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋來(lái)分析這些晶體蛋白。質(zhì)譜分析結(jié)果顯

4、示，Btssp.wuhanensis140菌株的135kDa和60kDa的主要蛋白的氨基酸序列與Bt的Cry1Ab16、CryE1、CryⅠG和Cry2Ac有很高的相似性。其中，Btssp.wuhanensis140菌株的60kDa質(zhì)譜結(jié)果顯示與數(shù)據(jù)庫(kù)中的CryⅡC有很高的同源性。根據(jù)該質(zhì)譜分析結(jié)果，序列分析后，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出一個(gè)新的cry類基因。該克隆的推測(cè)氨基酸序列與正模標(biāo)本Cry2Ac1(即CryⅡC)蛋白97％同源。將序列

5、提交國(guó)際Bt基因命名委員會(huì)，被正式命名為Cry2Ac6。通過(guò)蛋白質(zhì)組分析這些蛋白，使蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中增添了一個(gè)來(lái)源于武漢亞種的新的殺蟲(chóng)晶體蛋白。 根據(jù)GenBank、EMBL、DDBJ和PDB公布的Bt幾丁質(zhì)酶基因序列，同源比對(duì)和保守區(qū)分析后，設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)Bt幾丁質(zhì)酶基因的引物，對(duì)ssp.wuhanensis140菌株檢測(cè)后，為陽(yáng)性信號(hào)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增了該幾丁質(zhì)酶基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該幾丁質(zhì)酶