蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種菌株YBT-020晶胞粘連表型相關(guān)因子的定位研究.pdf

1、大多數(shù)蘇云金芽胞桿菌的伴胞晶體在母細(xì)胞一側(cè)形成并隨芽胞的成熟裂解而釋放到環(huán)境中,與芽胞分離。而有些亞種(如幕蟲亞種),晶體位于芽胞外壁和芽胞衣之間,在芽胞成熟后不與芽胞分離,形成一種特殊的表型,在本文中稱之為晶胞粘連表型(spore-crystal-assosiation,簡(jiǎn)稱為SCA)。本室分離的蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種YBT-020就具有明顯的晶胞粘連現(xiàn)象。
　　 關(guān)于晶胞粘連的機(jī)制,國(guó)內(nèi)外均缺乏相關(guān)研究報(bào)道,Wojciech

2、owska等人(1999)從其研究的幕蟲亞種中找到兩個(gè)晶體蛋白基因cry26Aa和cry28Aa,以此為依據(jù),本室也從YBT-020菌株中克隆得到了這兩個(gè)cry同源基因,并在此基礎(chǔ)上展開了一系列研究工作。
　　 對(duì)本室已PCR克隆得到的cry26Aa和cry28Aa基因進(jìn)行測(cè)序,并重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR置換原基因中的錯(cuò)誤堿基。將糾正后的cry26Aa和cry28Aa分別或共同導(dǎo)入到無(wú)質(zhì)粒無(wú)晶體突變株BMB171,4Q7,CryB

3、等菌株中,不能產(chǎn)生SCA表型；導(dǎo)入到Y(jié)BT-020的無(wú)質(zhì)粒突變株中,也不能回復(fù)SCA表型。此結(jié)果說明僅僅靠特殊cry基因的表達(dá),不足以導(dǎo)致SCA,在YBT-020丟失的大質(zhì)粒上必然存在晶胞粘連相關(guān)因子,而這些因子在BMB171,4Q7,CryB等菌株中是缺乏的。
　　 將能形成菱形晶體的典型基因cry1Ca導(dǎo)入YBT-020中,發(fā)現(xiàn)除了粘連的晶體外,還出現(xiàn)了游離的菱形晶體。通常,蛋白質(zhì)的時(shí)空表達(dá)是受到啟動(dòng)子的調(diào)控,為了分辨SCA

4、取決于cry基因的啟動(dòng)子還是編碼區(qū),在cry26Aa和cry28Aa和常規(guī)基因cry1Ca的基礎(chǔ)上構(gòu)建了4個(gè)融合基因,并將其導(dǎo)入不同的宿主并觀察表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),由cry26Aa和cry28Aa的啟動(dòng)子和cry1Ca的編碼區(qū)構(gòu)成的融合基因?qū)隮BT-020中,產(chǎn)生的晶體表型和天然cry1Ca導(dǎo)入的情形一樣,而另兩個(gè)由cry1Ca的啟動(dòng)子和cry26Aa和cry28Aa的編碼區(qū)構(gòu)成的融合基因?qū)隮BT-020中僅能產(chǎn)生粘連型的晶體。此結(jié)果說

5、明cry基因的啟動(dòng)子不是SCA的決定因子,YBT-020的SCA機(jī)制可能只識(shí)別具備特殊序列的晶體蛋白。
　　 構(gòu)建基因置換載體,對(duì)YBT-020進(jìn)行cry26Aa和cry28Aa的基因敲除,最終得到cry28Aa的基因敲除突變株J2,同時(shí)cry28所屬的天然大質(zhì)粒pBMB28上即帶上抗性標(biāo)記。J2依然具SCA表型,說明SCA不需要兩個(gè)晶體蛋白基因共表達(dá)。0ry26Aa雖然沒能成功中斷,但也得到了在其所在大質(zhì)粒上插入抗性標(biāo)記的突變

6、株J1。
　　 以J1和J2為大質(zhì)粒的供體菌進(jìn)行了一系列的接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明cry26所屬的天然大質(zhì)粒pBMB26上含有SCA形成的幫助因子,而pBMB28上含有幫助晶體穩(wěn)定存在的因子。同時(shí)發(fā)現(xiàn)pBMB26質(zhì)粒遺傳不穩(wěn)定,在轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)生缺失；并且其不能單獨(dú)轉(zhuǎn)移,總和pBMB28共轉(zhuǎn)移,推測(cè)其可能對(duì)pBMB28有復(fù)制依賴性。
　　 為了進(jìn)一步研究pBMB26上的SCA幫助因子,構(gòu)建了含有cry26Aa和cry28