蘇云金桿菌cry1Aa基因的表達(dá)和定點(diǎn)突變.pdf

1、文獻(xiàn)報(bào)道昆蟲中腸液pH值變化使其對(duì)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)殺蟲劑產(chǎn)生抗性,其生理機(jī)制有待進(jìn)一步探索.該研究運(yùn)用改進(jìn)的SDS堿裂解法抽提Bt 4.0718菌株的質(zhì)粒,通過(guò)PCR分析證實(shí)其P<,3>質(zhì)粒上含有cry1Aa基因.采用生物信息學(xué)方法通過(guò)比較cry1Aa基因的同源性,設(shè)計(jì)引物從P3質(zhì)粒上直接擴(kuò)增出cry1Aa基因的ORF,亞克隆至pMD18-T載體,經(jīng)BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切后

2、連接pET30a載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3),獲得的重組菌株ETAa經(jīng)誘導(dǎo),高效表達(dá)了141-kD融合蛋白.該研究中,針對(duì)cry1Aa基因設(shè)計(jì)出三條特異引物,采用二步PCR法引入突變.將第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為第二步PCR反應(yīng)的大引物,擴(kuò)增獲得的1048-bp片段亞克隆至pMD18-T載體,pMDMX質(zhì)粒用NHeⅠ和BssHⅡ雙酶切,獲得224-bp突變片段,與經(jīng)同樣酶切消化的pMDAa連接轉(zhuǎn)化,獲得重組質(zhì)粒pM

3、DMa,pMDMa用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切獲得的3.5-kb片段與經(jīng)同酶切的pET30a載體連接并轉(zhuǎn)化,得到C812A、C814A的突變株ETMa.突變株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后同樣獲得高效表達(dá).未突變菌株ETAa和突變菌株ETMa產(chǎn)生的包涵體均在不同pH值和β-巰基乙醇濃度下溶解,結(jié)果顯示在相同的pH值和β-巰基乙醇濃度下,突變株產(chǎn)生的包涵體更易溶解,而且在較低的pH值和β-巰基乙醇濃度下,突變株產(chǎn)生的包涵體的溶解性也更好.證明C81