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文檔簡介
1、DNase B是A組乙型溶血性鏈球菌(GAS)的一種分泌蛋白,序列高度保守,幾乎存在于所有GAS中,Anti-DNase B檢測可作為GAS感染引起的疾病的最佳診斷檢測方法。然而DNase B的純化工藝復(fù)雜,獲取成本昂貴,因而無法滿足大量臨床診斷檢測的需要。本課題研究工作的目的在于:通過基因工程的途徑構(gòu)建DNase B原核表達(dá)載體,并獲得DNaSe B高效表達(dá)。以尋找低成本、大批量的獲得抗原性較強(qiáng)的重組DNaseB的方法,為GAS診斷檢
2、測試劑和疫苗的研制打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。 本課題研究設(shè)計了獲得重組DNase B蛋白的兩條實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線: 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線1:運(yùn)用PCR技術(shù),從質(zhì)粒pMOl8一T-DNase B中擴(kuò)增出0.5 kb截短的ONase B基因片段,將其亞克隆構(gòu)建新的原核表達(dá)載體pET-28a(+)-DNase B,經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定正確后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其目的蛋白(約22kd)得到了表達(dá)。Western-b10t
3、ting試驗(yàn)結(jié)果表明:菌體表達(dá)的DNase B蛋白能與GAS感染患者的強(qiáng)陽性血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)。但實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線1獲得目的蛋白表達(dá)量較低。 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線2:采用PCR體外定點(diǎn)突變技術(shù)(PCR-SDM),對DNase B活性位點(diǎn)的堿基序列進(jìn)行突變,獲得突變的DNase B基因,TA克隆后測定其核苷酸序列。將其定向克隆入pET-28a(+)載體,構(gòu)建新的原核表達(dá)載體,經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定正確后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)
4、。表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳檢測表明,目的蛋白(約29kd)主要以包涵體形式實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。包涵體蛋白用不同濃度的尿素洗滌后,溶解于8mo1/L尿素溶液中,經(jīng)Ni-NTA凝膠親和層析,得到單一的目的蛋白條帶。并且對重組DNase B蛋白進(jìn)行BCA法定量檢測分析。 我們對DNase B融合蛋白進(jìn)行了免疫學(xué)試驗(yàn)。Western-blotting試驗(yàn)結(jié)果顯示:重組的His-DNase B融合蛋白能夠與GAS感染患者的
5、陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。說明經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測的蛋白就是GAS菌的DNase B蛋白。乳膠凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示:用該蛋白抗原致敏的乳膠顆粒能與GAS感染患者的陽性血清發(fā)生明顯的凝集。ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示:重組DNase B蛋白的抗原特異性良好。 為了獲得大量的DNase B蛋白,我們對DNase B蛋白表達(dá)的發(fā)酵條件進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化。確定DNase B蛋白高效表達(dá)的發(fā)酵條件的最佳組合為A2B1C1D3,即接種量2%、誘導(dǎo)
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