羽衣甘藍(lán)PCNA基因克隆、亞細(xì)胞定位及蛋白表達(dá)分析.pdf

1、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作為一種真核生物中廣泛存在的蛋白質(zhì)，通過其特殊的三級結(jié)構(gòu)，與DNA結(jié)合并且募集相應(yīng)的蛋白，參與DNA復(fù)制、DNA修復(fù)以及細(xì)胞周期等多種過程。羽衣甘藍(lán)（Brassica oleracea var.acephala）屬于十字花科蕓薹屬，具有較強(qiáng)的耐寒性和觀賞性，是秋冬季節(jié)城市綠化的重要景觀植物。本研究以羽衣甘藍(lán)S13-bS13-b自交不親和系為研

2、究材料，分離羽衣甘藍(lán)PCNA1和PCNA2基因全長并進(jìn)行序列分析;利用Gateway技術(shù)構(gòu)建帶有GFP標(biāo)簽的表達(dá)載體，進(jìn)行PCNA亞細(xì)胞定位研究;通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，原核表達(dá)純化獲得PCNA蛋白，免疫小鼠制備多克隆抗體;對羽衣甘藍(lán)不同組織及不同發(fā)育階段的柱頭進(jìn)行蛋白檢測，分析PCNA蛋白表達(dá)的時空性。這些研究為PCNA的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:
　　1、通過RT-PCR和RACE克隆技術(shù)從羽衣甘藍(lán)柱頭中分離

3、得到了PCNA1和PCNA2基因。PCNA1基因全長為1127bp，其中包含5'非翻譯區(qū)126bp，3'非翻譯區(qū)209bp，開放閱讀框792bp，對應(yīng)編碼一個263個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為29.16 kDa，等電點(diǎn)PI為4.61;PCNA2基因全長為1092bp，其中包含5'非翻譯區(qū)87bp，3'非翻譯區(qū)213bp，開放閱讀框792bp，對應(yīng)編碼一個263個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量為28.99 kDa，等電點(diǎn)PI

4、為4.55。PCNA1和PCNA2兩個氨基酸序列比對分析結(jié)果表明其序列相似性為96％，有10個氨基酸差異。
　　2、經(jīng)過信息生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PCNA1和PCNA2存在相同的保守區(qū)域，如DNA結(jié)合位點(diǎn)、PCNA/WAF1-CIP1蛋白結(jié)合位點(diǎn)、PCNA/RFCL蛋白結(jié)合位點(diǎn)、PCNA/Fen-1蛋白結(jié)合為點(diǎn)等，屬于PCNA超家族。
　　3、根據(jù)克隆獲得的PCNA1和PCNA2基因序列，利用Gateway技術(shù)分別構(gòu)建PCNA1/2

5、-PK7WGF2表達(dá)載體。使用PEG-鈣離子介導(dǎo)擬南芥原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位法研究發(fā)現(xiàn)，通過Egfp融合蛋白熒光顯示PCNA1和PCNA2主要表達(dá)于細(xì)胞核，說明其可能在細(xì)胞核中發(fā)揮功能，參與DNA復(fù)制及細(xì)胞周期等功能。
　　4、通過雙酶切的方法，使用KpnⅠ和BamHⅠ兩種內(nèi)切酶，成功構(gòu)建了pET-14b-PCNA1和pET-14b-PCNA2兩種表達(dá)質(zhì)粒;誘導(dǎo)表達(dá)PCNA1和PCNA2蛋白，通過SDS-PAGE電泳，在約35 kDa

6、處有明顯條帶;通過Ni-NTA樹脂，對含有His標(biāo)簽的PCNA1和PCNA2蛋白進(jìn)行純化，純化得到PCNA1和PCNA2蛋白。
　　5、以純化的PCNA1和PCNA2蛋白為抗原，免疫小鼠，制備PCNA1和PCNA2抗體;通過ELISA對抗體效價進(jìn)行檢測，其中PCNA1免疫的三只小鼠中，2號小鼠效價最高;PCNA2免疫的三只小鼠中，2號小鼠效價最高。
　　6、提取羽衣甘藍(lán)莖、葉、花瓣、花藥、柱頭、花柱、子房及柱頭不同發(fā)育時期植