家蠶LDLRD蛋白的表達(dá)分析及其亞細(xì)胞定位.pdf

1、低密度脂蛋白受體(Th.Lo.Densit.Lipoprotei.Receptor，LDLR)是一種細(xì)胞表面糖蛋白，主要功能是結(jié)合并內(nèi)吞LDL，在膽固醇代謝中起關(guān)鍵作用。當(dāng)LDLR功能缺陷時(shí)可導(dǎo)致家族性高膽固醇血(fanulia.hypercholesterolemia，F(xiàn)H)及早發(fā)冠心病。隨著對(duì)低密度脂蛋白受體(LDLR)研究的不斷深入，將有助于進(jìn)一步了解高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化(AS)等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和指導(dǎo)臨床治療。目前人們

2、對(duì)LDLR基因表達(dá)的研究主要集中在人、兔、鼠上。因此，進(jìn)一步研究LDLR在其他動(dòng)物膽固醇平衡中的作用，以及進(jìn)一步闡明LDLR的表達(dá)調(diào)控機(jī)制都將具有十分重要的意義。
　　 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中獲得一條cDNA序列，經(jīng)同源比對(duì)分析，與人小鼠等的低密度脂蛋白受體同源，因此，將其命名為家蠶低密度脂蛋白受體基因--Bmldlr。GenBank登錄號(hào)是FJ602781.其開放閱讀框長(zhǎng)度45.bp，編碼由151個(gè)氨基酸殘基組成

3、的肽鏈。經(jīng)DNAstar軟件分析其分子量為16.4.kDa，等電點(diǎn)為5.84。根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，并分別引入EcoRI和Xh.I酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物雙酶切后連入原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a，成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Bmldlr。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，用終濃度為.mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，裂解菌體作SDS-PAGE分析，在2.kDa左右的位置有一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期值(融合標(biāo)簽+BmL

4、DLRD)相符。融合蛋白先后經(jīng)Sephade.G50分子篩層析及Ni親和柱純化，獲得純化的融合蛋白。用純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，ELISA法測(cè)得抗體效價(jià)為1：12800。利用多克隆抗體對(duì)家蠶細(xì)胞Bm5進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明BmLDLRD主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)也進(jìn)行了熒光定量PCR分析不同組織及各發(fā)育時(shí)期該基因的表達(dá)差異，定量?jī)?nèi)參選用18SrRNA，結(jié)果顯示在各組織中，脂肪體表達(dá)量最高，生殖器表達(dá)量次之，中腸中的表達(dá)量