家蠶BmNADHb5的表達(dá)分析及其亞細(xì)胞定位.pdf

1、從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選出一條438 bp的基因序列(基因登錄號(hào):EU826676),編碼150個(gè)氨基酸殘基,序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)是NDUF-b5家族的一個(gè)亞基,將該基因命名為BmNADHb5(Bombyx mori Nicotinamide adenine dinucleotide hydridecyto-chrome b5 reductase)。
　　 目的片段經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后插入到高效表達(dá)載體pET-

2、28a(+)中,成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-BmNADHb5,在E.coli Rosetta中過度表達(dá)重組的pET-28a(+)-BmNADHb5并純化蛋白。超聲破碎表達(dá)產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)以包涵體的形式存在于沉淀中,我們通過鎳柱進(jìn)行純化,以純化的融合蛋白為抗原多次免疫一只雄性新西蘭兔,獲得的抗體用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)得其效價(jià)為1:12800以上。我們提取了家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個(gè)時(shí)期的總蛋白和總RNA,又選擇五

3、齡幼蟲第三天作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來研究BmNADHb5的組織分布情況,提取了家蠶的頭、表皮、馬氏管、氣管、脂肪體、絲腺、睪丸和卵巢等組織的總蛋白和總RNA。我們用ELISA半定量法和Western blit以及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BmNADHb5的表達(dá)分析及其分布。ELISA半定量法和Western blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)BmNADHb5蛋白在家蠶各發(fā)育時(shí)期都有表達(dá),其中卵期表達(dá)量明顯高于其他發(fā)育時(shí)期,在各組織中,氣管、生殖器等表達(dá)量較高。熒光