家蠶微孢子蟲烯醇化酶的表達特性分析及亞細胞定位.pdf

1、江蘇科技大學攻讀碩士學位研究生江蘇科技大學攻讀碩士學位研究生論文摘要論文摘要論文題目家蠶微孢子蟲烯醇化酶的表達特性分析及亞細胞定位研究方向微生物分子生物學學科、專業(yè)微生物學研究生姓名彭祥然導師姓名沈中元填表時間2017年06月01日學號：學號：142310006摘要：摘要：新陳代謝是生命體生命活動的基礎，是物質代謝和能量代謝的結合。微孢子蟲是細胞內寄生的真核生物，宿主域廣泛，寄生環(huán)境的復雜多樣使得不同種屬的微孢子蟲的代謝情況存在很大的差

2、異。對微孢子蟲的基因組分析發(fā)現(xiàn)其基因組中編碼蛋白的序列在長度和數(shù)量上都有著很大程度的縮減，尤其是與代謝相關的基因，因此微孢子蟲的代謝研究一直是學者關注的熱點。對家蠶微孢子蟲的基因組分析發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲擁有完整的糖酵解途徑，能夠通過該途徑獲取生命活動所需的部分能量。烯醇化酶（Enolase，ENO）是糖酵解過程中的限速酶，對烯醇化酶的研究能夠為我們更好地了解微孢子蟲的能量代謝提供一定的基礎。且近年來也有烯醇化酶新的功能的發(fā)現(xiàn)報道，因此烯醇

3、化酶在家蠶微孢子蟲的生命活動中是否參與到其他的過程當中也是我們關注的問題。本研究依據(jù)微孢子蟲數(shù)據(jù)庫中家蠶微孢子蟲烯醇化酶的編碼序列設計引物，以家蠶微孢子蟲DNA為模板PCR擴增獲得家蠶微孢子蟲烯醇化酶基因NbENO。生物信息學分析結果顯示該基因F全長1239bp，編碼413個氨基酸，預測蛋白質分子質量46.323kD，等電點6.13；蛋白質二級結構主要由α螺旋（28.33%）、延伸片段（22.52%）和無規(guī)則卷曲（49.15%）組成；含

4、有25個磷酸化位點和1個糖基化位點；無信號肽和跨膜結構域存在，不具備典型的分泌蛋白和跨膜蛋白的特征。通過與數(shù)據(jù)庫中其他12種微孢子蟲的烯醇化酶的系統(tǒng)進化樹分析結果顯示NbENO與蜜蜂微孢子蟲烯醇化酶基因序列（NcENO）的親緣關系較近，序列比對顯示二者的編碼基因一致性為62.10%。將NbENO基因插入原核表達載體pET28a，構建原核表達載體pET28aNbENO，在目的蛋白N端引入6His標簽；重組質粒轉化Rosatta（DE3）感

5、受態(tài)細胞，構建重組蛋白NbENO的原核表達系統(tǒng)，經(jīng)IPTG誘導表達。SDSPAGE檢測和WesternBlot的檢測結果顯示誘導表達的重組蛋白約50kD大小，結果與預測相符，證明成功地獲得了原核表達的重組蛋白NbENO。通過鎳親和柱純化獲得重組蛋白NbENO，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，通過ProteinA親和純化抗體antiNbENOAb。經(jīng)ELISA檢測抗體效價為1:512000，WesternBlot驗證顯示antiNbENO