家蠶微孢子蟲serpinNBO_39gi001基因的表達(dá)定位及serpin的功能初探.pdf

1、微孢子蟲(microsporidia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物，能感染幾乎所有的無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，包括人類，是經(jīng)濟(jì)昆蟲、魚類、兔類、產(chǎn)毛動(dòng)物、嚙齒類及靈長(zhǎng)類的常見病原，目前已發(fā)現(xiàn)約有150個(gè)屬，1400余種。家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)是人類最早發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲，主要寄生于經(jīng)濟(jì)昆蟲家蠶，是家蠶微粒子病的病原，因其可以通過胚種垂直傳播，因而危害巨大，被列為蠶業(yè)生產(chǎn)上的法定檢疫對(duì)象。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)蠶大國(guó)，每年因

2、微粒子病和帶毒種造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)上千萬元，因此，研究家蠶微孢子蟲具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。事實(shí)上，攻克家蠶微粒子病一直是蠶業(yè)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，特別是如何能夠在家蠶發(fā)病的早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)采取相應(yīng)措施，使損失降到最低是目前十分受關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室完成了家蠶微孢子全基因組測(cè)序及框架圖的繪制，為家蠶微孢子的研究提供了信息基礎(chǔ)。通過生物信息學(xué)分析，我們鑒定出一個(gè)家蠶微孢子蟲serpin型絲氨酸蛋白酶抑制物基因家族，并在已報(bào)道

3、的微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)中也有serpin基因。Serpin基因在多數(shù)生物進(jìn)程中發(fā)揮著不同的功能。在生物的進(jìn)化過程中，病原生物采用特殊的策略逃避宿主的防御機(jī)制，已有報(bào)道，發(fā)現(xiàn)寄生物的serpin能抑制宿主的免疫反應(yīng)。家蠶微孢子蟲有可能分泌serpin蛋白，抑制宿主免疫防御反應(yīng)中的絲氨酸蛋白酶，下調(diào)免疫反應(yīng)，從而成功寄生于家蠶體內(nèi)。本研究旨在已有的信息基礎(chǔ)上，鑒定家蠶微孢子蟲的serp

4、in基因，對(duì)其功能進(jìn)行探索，為家蠶微孢子蟲與宿主間的互作研究提供參考。
　　 本研究利用生物信息學(xué)分析，鑒定出家蠶微孢子蟲的serpin基因家族，然后通過轉(zhuǎn)錄譜分析，選擇其中一條serpin基因序列，進(jìn)行克隆、原核表達(dá)及膠體金免疫電鏡定位分析，同時(shí)對(duì)獲得的可溶性表達(dá)蛋白進(jìn)行了功能分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.家蠶微孢子蟲serpin家族的序列及轉(zhuǎn)錄譜分析從家蠶微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過生物信息學(xué)分析，共鑒定了12

5、個(gè)serpin，將這12條序列與其他物種的serpin進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，家蠶微孢子蟲與其它物種的serpin相似性低，然后對(duì)serpin RCL區(qū)鉸鏈區(qū)進(jìn)行分析，NBO_34g0030，NBO_42g0004，NBO_18g0021，NBO_18g0004，NBO_372g0002，NBO_34g0036，NBO_19g0009的P16-P9氨基酸殘基都發(fā)生了很大的突變，說明它們可能是非抑制型serpin。
　　 對(duì)家蠶微孢

6、子蟲serpin蛋白P1位點(diǎn)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，NBO_124g0001，NBO_1569g0001，NBO_19g0007，NBO_1570g0002，NBO_19g0009，NBO_372g0002，它們的P1位點(diǎn)預(yù)測(cè)都是天冬氨酸；NBO_18g0004和NBO_34g0036的P1位點(diǎn)都是谷氨酸，目前還不能推測(cè)這8條serpin蛋白可能的靶標(biāo)；NBO_34g0030，NBO_42g0004的P1位點(diǎn)是苯丙氨酸，NBO_39gi001 P1

7、位點(diǎn)是酪氨酸，這3個(gè)serpin蛋白可能以胰凝乳蛋白酶為靶標(biāo)；NBO_18g0021預(yù)測(cè)P1位點(diǎn)為賴氨酸，可能的靶標(biāo)為胰蛋白酶。
　　 為了分析感染家蠶后家蠶微孢子蟲serpins的轉(zhuǎn)錄情況，我們對(duì)四齡起蠶的家蠶添食微孢子蟲，取感染后1-7天的中腸組織做RT-PCR。轉(zhuǎn)錄譜分析表明，serpin NBO_1570g0002在添食后1-7天都有轉(zhuǎn)錄活性，NBO_18g0004，NBO_39gi001分別在4-7天，5-7天有轉(zhuǎn)錄活

8、性，說明這兩個(gè)serpin蛋白很有可能在侵染后期發(fā)揮作用；而NBO_372g0002，NBO_34g0030分別在第7天，第5天有轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)錄活性沒有規(guī)律性。綜合生物信息學(xué)分析及轉(zhuǎn)錄譜結(jié)果，推測(cè)分泌型serpinNBO_1570g0002，NBO_39gi001有可能參與家蠶微孢子蟲與宿主家蠶的互作。
　　 2.家蠶微孢子蟲serpin基因NBO_39gi001克隆及原核表達(dá)在信息分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合轉(zhuǎn)錄譜分析的結(jié)果，選擇ser

9、pin NBO_39gi001，進(jìn)行克隆、構(gòu)建表達(dá)重組載體pGEX4T-1-NBO_39gi001，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了目的蛋白，切膠純化蛋白免疫小鼠制備抗血清，用家蠶微孢子蟲的總蛋白作為抗原，western blotting檢測(cè)，結(jié)果出現(xiàn)了一條特異性條帶，但與預(yù)測(cè)的大小不符合，推測(cè)其原因可能是serpin與靶標(biāo)形成了復(fù)合物。
　　 3.家蠶微孢子蟲serpin蛋白的定位及功能初探采用免疫膠體金電鏡技術(shù)來確定serpin

10、NBO_39gi001蛋白表達(dá)的特異性及定位特點(diǎn)，結(jié)果在成熟孢子的胞原質(zhì)有膠體金顆粒分布，說明serpin NBO_39gi001在成熟孢子中有表達(dá)。
　　 目前，原核表達(dá)的3個(gè)serpin融合蛋白-GST-NBO_372g002、GST-NBO_1570g0002和GST-NBO_39gi001，只有GST-NBO_1570g0002有可溶性表達(dá)蛋白，因此，將原核表達(dá)可溶的GST-NBO_1570g0002作為研究對(duì)象，對(duì)其功

11、能進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GST-NBO_1570g0002不能抑制家蠶血液中的酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)(PO級(jí)聯(lián))；也不能抑制絲氨酸蛋白酶Subtilisin及蛋白酶K，推測(cè)可能的原因是：第一，家蠶微孢子蟲屬于真核生物，表達(dá)的蛋白要經(jīng)過修飾，而原核表達(dá)系統(tǒng)沒有蛋白修飾，因此原核表達(dá)的GST-NBO_1570g0002沒有活性；第二，serpin型絲氨酸蛋白酶抑制物功能多樣，GST-NBO_1570g0002可能并不參與抑制宿主的PO級(jí)聯(lián)反應(yīng)；第三，