微孢子蟲感染誘導(dǎo)的家蠶應(yīng)答反應(yīng)及對(duì)其免疫信號(hào)通路的激活.pdf

1、宿主-病原體之間的相互作用非常復(fù)雜，近年來對(duì)宿主與病原體之間相互作用的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。家蠶微孢子蟲N. bombycis是一種主要的家蠶病原體，其引起的家蠶微粒子病會(huì)給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。對(duì)家蠶對(duì)微孢子蟲侵染的應(yīng)答反應(yīng)和兩者之間相互作用的深入了解，有助于微粒子病的防治和治療。在昆蟲中，中腸是消化和攝食營(yíng)養(yǎng)的重要器官，同時(shí)也作為抵抗病原體入侵的第一道防線，因此，中腸是研究微孢子蟲及其宿主-家蠶相互作用的理想模型。本研究建立了微孢子蟲感

2、染的家蠶BmN細(xì)胞體系，對(duì)微孢子蟲在細(xì)胞內(nèi)的增殖進(jìn)行了觀察研究，利用 illumina基因組測(cè)序分析平臺(tái)對(duì)攝食感染微孢子蟲后6、12、18、24、48、72和96 h的家蠶中腸表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。同時(shí)，利用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了微孢子蟲感染后，家蠶免疫系統(tǒng)中參與信號(hào)識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　1.家蠶微孢子蟲體外感染增殖體系的建立。通過堿處理法誘導(dǎo)家蠶微孢子蟲發(fā)芽，并利用家蠶 BmN細(xì)胞系進(jìn)行接種培養(yǎng)。觀察其增

3、殖發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲在宿主細(xì)胞中的發(fā)育是一個(gè)逐漸變化的過程。隨著微孢子蟲的不斷增殖，占領(lǐng)宿主細(xì)胞質(zhì)空間并裂解宿主細(xì)胞，釋放出來的微孢子蟲對(duì)周圍細(xì)胞進(jìn)行侵染，最終占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)空間。該體系的建立為家蠶微孢子蟲基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究打下了基礎(chǔ)。
　　2.微孢子蟲感染引起的家蠶應(yīng)答反應(yīng)。通過對(duì)微孢子蟲感染后的家蠶中腸進(jìn)行的數(shù)字基因表達(dá)譜研究，共得到1902個(gè)差異表達(dá)基因，包括1168個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因和734個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因。而且在微孢子蟲

4、感染的不同時(shí)期，差異表達(dá)基因的個(gè)數(shù)處于動(dòng)態(tài)變化之中，并且與微孢子蟲在宿主體內(nèi)的的增殖呈一定的相關(guān)性；對(duì)不同時(shí)間段的差異基因進(jìn)行聚類分析結(jié)果表明，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)都發(fā)生差異表達(dá)的基因只有3個(gè)；在6 h、24 h、48 h和96 h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)都差異表達(dá)的基因有7個(gè)，在這些基因中，多數(shù)都與家蠶的生理代謝相關(guān)并呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；對(duì)差異基因進(jìn)行的GO富集分析結(jié)果顯示：微孢子蟲感染的不同時(shí)期，不同功能的蛋白表達(dá)差異較大，早期主要為參與家蠶正常代謝和蛋白功能

5、相關(guān)的蛋白，后期則為細(xì)胞組成相關(guān)蛋白基因的差異表達(dá)；KEGG富集分析鑒定出出Lysine degradation、SNARE interactions in vesicular transport、Folate biosynthesis等24條顯著差異的代謝途徑，表明微孢子蟲侵染對(duì)家蠶葉酸合成、剪接體、煙酸和煙酰酸代謝、自噬等代謝途徑有很大影響。此外，數(shù)字基因表達(dá)譜還鑒定出一些參與家蠶先天性免疫的一些基因。
　　3.微孢子蟲感染對(duì)

6、家蠶免疫信號(hào)通路的激活。通過熒光定量 PCR的方法，對(duì)微孢子蟲感染家蠶后家蠶免疫系統(tǒng)中信號(hào)識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的進(jìn)行了表達(dá)譜分析，結(jié)果表明：家蠶信號(hào)識(shí)別相關(guān)的基因BGRP1-4、PGRP，CTL-5，GNBP等都有顯著的上調(diào)表達(dá)，表明家蠶對(duì)微孢子蟲的侵染具有有效的識(shí)別效果；多數(shù)參與 Imd、Toll和JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因也有相應(yīng)的表達(dá)變化，表明微孢子蟲的侵染激活了家蠶先天性免疫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終引起相關(guān)免疫效應(yīng)因子的轉(zhuǎn)