家蠶抗菌免疫信號(hào)通路相關(guān)因子的研究.pdf

1、昆蟲是地球上數(shù)量最龐大種類最多的動(dòng)物群體，目前已知的昆蟲種類有100多萬種，近年來的研究表明，地球上昆蟲的實(shí)際種數(shù)可能達(dá)到1000萬種，約占全球生物種數(shù)的一半，在生態(tài)系統(tǒng)中占重要地位。在長期的進(jìn)化歷程中，為了克服各種不良的環(huán)境條件，抵御病源微生物的感染和寄生，昆蟲進(jìn)化出了一套高效的先天性免疫系統(tǒng)。昆蟲的先天性免疫系統(tǒng)主要分為體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫主要通過血淋巴的黑化作用和抗菌肽分泌實(shí)現(xiàn)。其中，抗菌肽主要由脂肪體、血細(xì)胞以及其他組織

2、由于細(xì)菌感染激發(fā)合成，并通過Toll和immunedeficiency(IMD)信號(hào)通路的調(diào)控實(shí)現(xiàn)抗菌功能。
　　雖然家蠶的抗菌免疫通路因子研究主要參考果蠅的研究，而且果蠅參與Toll和IMD信號(hào)通路的蛋白在家蠶中大多都能找到對(duì)應(yīng)的同源蛋白，但是家蠶與果蠅的免疫抗菌通路對(duì)外源菌的識(shí)別和通路激活機(jī)制并不相同，這也導(dǎo)致了在受到外源菌感染后，家蠶抗菌肽的激活表達(dá)方式可能與果蠅存在差異。此外，保幼激素(JH)能促進(jìn)果蠅部分抗菌肽表達(dá)，但在

3、家蠶則抑制這些AMP基因的表達(dá);而蛻皮激素(20E)抑制果蠅抗菌肽的表達(dá)，但在家蠶中卻誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)。
　　本論文在分析比較家蠶EST和基因組數(shù)據(jù)庫中Toll及IMD信號(hào)通路相關(guān)因子與哺乳動(dòng)物Toll-like Receptor(TLR)信號(hào)通路、Tumor necrosis factorα(TNF-α)、果蠅Toll及IMD信號(hào)通路同源因子同源性的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR、熒光定量PCR等技術(shù)對(duì)家蠶中部分基因進(jìn)行了研究，具體研究

4、結(jié)果如下:
　　1.我們對(duì)BmSmt3、BmRelA、CecorpinB1進(jìn)行了金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)24小時(shí)內(nèi)這些基因表達(dá)量變化進(jìn)行qRT-PCR檢測，在分析比對(duì)先前實(shí)驗(yàn)室研究之后，我們發(fā)現(xiàn)同樣是Lys型肽聚糖的藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌激活BmSmt3和BmRelA的表達(dá)時(shí)，BmSmt3與BmRelA的表達(dá)變化趨勢(shì)具有相似性，我們推測革蘭氏陽性菌激發(fā)Toll信號(hào)通路時(shí)，可能會(huì)造成BmRelA與BmSmt3的同步表達(dá)。

5、r>　　2.為了驗(yàn)證以上推測，我們采用具備革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁，但是肽聚糖類型為DAP型的枯草芽孢桿菌作為誘導(dǎo)菌。在同樣免疫實(shí)驗(yàn)并檢測BmSmt3、BmRelA、CecorpinB1表達(dá)變化之后，我們發(fā)現(xiàn)，即便肽聚糖識(shí)別位點(diǎn)類型不同，革蘭氏陽性菌仍然可以激活Toll信號(hào)通路，且表現(xiàn)為BmRelA和BmSmt3的同步表達(dá)。
　　3.為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同而非肽聚糖類型不同是導(dǎo)致Toll信號(hào)通路激活的主要原因，我們換用DAP型肽聚

6、糖但是卻是革蘭氏陰性菌的大腸桿菌作為誘導(dǎo)菌。結(jié)果表明，大腸桿菌未能誘導(dǎo)BmSmt3與BmRelA的表達(dá)。CecorpinB1在大腸桿菌誘導(dǎo)之后的表達(dá)很可能是通過IMD因子BmRelish1的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。
　　4.為了探究BmSmt3、BmRelA、CecorpinB1在真菌和細(xì)菌誘導(dǎo)之后的差異，我們換用白僵菌作為誘導(dǎo)菌。通過對(duì)免疫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析后，我們發(fā)現(xiàn)，雖然白僵菌的誘導(dǎo)上調(diào)了BmSmt3和BmRelA表達(dá)，且變化幅度類似，

7、但是對(duì)CecorpinB1誘導(dǎo)效果卻遠(yuǎn)高于細(xì)菌。這說明，白僵菌感染家蠶后，抗菌肽的表達(dá)很可能得到了Toll及IMD信號(hào)通路協(xié)同調(diào)節(jié)作用。
　　5.我們首次在家蠶中鑒定出家蠶保幼激素酯酶結(jié)合蛋白（Bombyx morijuvenile hormone esterase binding protein，BmJHEBP），通過數(shù)據(jù)檢索、電子克隆、RT-PCR等方法，克隆了家蠶BmJHEBP基因。BmJHEBP全長序列由963bp組成，5

8、’端UTR和3’端UTR分別為84bp和147bp，ORF長為732bp，編碼243個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)方法分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與功能信息，我們發(fā)現(xiàn)BmJHEBP氨基酸序列包含有N-端線粒體信號(hào)肽序列（1-43位氨基酸）、C-端含有一個(gè)類Tim44結(jié)構(gòu)域（86-151位氨基酸）。對(duì)BmJHEBP基因組織特異性及時(shí)間特異性表達(dá)檢測結(jié)果顯示:BmJHEBP的表達(dá)在蛻皮期較高，在預(yù)蛹期降到最低，與JHE的表達(dá)及JHIII和20E表達(dá)的相吻